曾蘭花，張坤，袁煥合，吳躍麗，黎嘉茗，周羽飛，黃俊忠

(1.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663； 2.廣東一力羅定制藥有限公司，廣東 云浮 527200)

復(fù)方川貝止咳糖漿是由川貝母、苦杏仁、枇杷葉、百部、化橘紅、紫蘇子、麻黃、百合、桑白皮、桔梗、甘草、薄荷腦等18味藥材或提取物組成的復(fù)方制劑[1]。具有鎮(zhèn)咳祛痰、潤肺定喘的功能，用于傷風(fēng)咳嗽、痰多、氣喘?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有理化鑒別、相對密度檢查等項目，不足以全面反映其整體質(zhì)量。因此，本文參考相關(guān)文獻，建立了化橘紅、薄荷腦、枇杷葉、麥冬、川貝母、甘草的TLC鑒別方法和甘草酸、柚皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法[2-14]，為復(fù)方川貝止咳糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-20A型紫外檢測器(日本島津公司)；SPD-M20A型二極管陣列檢測器(日本島津公司)；TLC Visualizer薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)；KQ-A1000GDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，頻率40 kHz，功率1 000 W)；Silica gel 60薄層板(Merck公司，規(guī)格：10 cm×20 cm)。

1.2 試藥

化橘紅對照藥材(批號：121165-201003)、柚皮苷對照品(批號：110722-201613，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.3%)、薄荷腦對照品(批號：110728-200506，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、熊果酸對照品(批號：110742-200313，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、枇杷葉對照藥材(批號：121261-201303)、麥冬對照藥材(批號：121013-201310)、西貝母堿對照品(批號：110767-201609，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.0%)、甘草對照藥材(批號：120904-201519)、甘草苷對照品(批號：111610-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.1%)、甘草酸銨對照品(批號：110731-201619，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.0%)、柚皮苷對照品(批號：110722-201312，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.3%)均購自中國食品藥品檢定研究院。

9批復(fù)方川貝止咳糖漿(批號：170101、170102、170103、170104、170105、170106、170107、170109、161104)及化橘紅陰性樣品、薄荷腦陰性樣品、枇杷葉陰性樣品、麥冬陰性樣品、川貝母陰性樣品、甘草陰性樣品，均由廣東一力羅定制藥有限公司提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 化橘紅的鑒別 取本品100 mL，加乙醚70 mL振搖提取，乙醚液備用，水層加乙酸乙酯100 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取化橘紅陰性樣品100 mL，同法制成陰性對照溶液。另取化橘紅對照藥材1 g，加甲醇10 mL，于電爐上加熱回流20 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。再取柚皮苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。按照薄層色譜法試驗[3]，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(體積比9∶3∶1)為展開劑，展開、取出、晾干，噴以3%(質(zhì)量濃度)AlCl3乙醇溶液，晾干，在紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

123456789101112

1～9.供試品(170101～170107、170109、161104); 10.化橘紅陰性對照; 11.化橘紅對照藥材； 12.柚皮苷對照品。

圖1化橘紅鑒定薄層色譜圖
Figure1Identification of Citri grandis exocarpium by TLC

2.1.2 薄荷腦的鑒別 取“2.1.1”項下的乙醚液，加活性炭2 g，攪拌，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。取薄荷腦陰性樣品100 mL，同法制成陰性對照溶液。另取薄荷腦對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[3]，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比8∶3)為展開劑，將薄層板在展開缸中預(yù)平衡10 min，展開、取出、晾干，噴以1%(質(zhì)量濃度)香草醛H2SO4溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

1234567891011

1～9.供試品(170101～170107、170109、161104); 10.薄荷腦陰性對照； 11.薄荷腦對照品。

圖2薄荷腦鑒定薄層色譜圖
Figure2Identification of Menthol by TLC

2.1.3 枇杷葉的鑒別 取本品100 mL，加濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至10，加乙醚100 mL振搖提取，分取乙醚提取液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取枇杷葉陰性樣品100 mL，同法制成陰性對照溶液。另取枇杷葉對照藥材0.5 g，加水微沸煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至約20 mL，自“加濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至10”起，同法制成對照藥材溶液。再取熊果酸對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，分別吸取上述供試品溶液8 μL、陰性對照溶液8 μL、對照藥材溶液和對照品溶液各2 uL，分別點于同一硅膠G薄層板上。將薄層板點樣的一端浸入1%碘-二氯甲烷溶液中約12～15 mm，使溶液浸過迅速取出，立即覆以一玻璃板，30 min后取下玻璃板，熱風(fēng)吹2～3 min，揮去薄層板上殘留的溶液，再以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(體積比4∶2∶0.1)為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%(體積分?jǐn)?shù))H2SO4乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖3。

123456789101112

1～9.(170101～170107、170109、161104); 10.枇杷葉陰性對照； 11.枇杷葉對照藥材； 12.熊果酸對照品。

圖3枇杷葉鑒定薄層色譜圖
Figure3Identification of eriobotry folium by TLC

2.1.4 麥冬的鑒別 取本品20 mL，加HCl 2 mL，置水浴上加熱30 min，放冷，用乙醚100 mL振搖提取，分取乙醚液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。取麥冬陰性樣品20 mL，同法制成陰性對照溶液。另取麥冬對照藥材2 g，加水50 mL煎煮30 min，濾過。濾液自“加鹽酸2 mL”起，同法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗，分別吸取上述供試品溶液2 μL、陰性對照溶液2 μL、對照藥材溶液4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(體積比3∶1)為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%(體積分?jǐn)?shù))H2SO4乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，見圖4。

1234567891011

1～9.供試品(170101～170107、170109、161104); 10.麥冬陰性對照； 11.麥冬對照藥材。

圖4麥冬鑒定薄層色譜圖
Figure4Identification of ophiopogonis radix by TLC

2.1.5 川貝母的鑒別 取本品100 mL，加濃氨溶液調(diào)節(jié)pH值至12，搖勻，加三氯甲烷200 mL振搖提取，分取三氯甲烷液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取川貝母陰性樣品100 mL，同法制成陰性對照溶液。另取西貝母堿對照品適量，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，分別吸取上述供試品溶液15 μL、陰性對照溶液15 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上。以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-濃氨試液(體積比9∶14∶1.5)的上層溶液為展開劑，展開、取出、晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，再置碘缸中熏至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖5。

1234567891011

1～9.供試品(170101～170107、170109、161104); 10.川貝母陰性對照； 11.西貝母堿對照品。

圖5川貝母鑒定薄層色譜圖
Figure5Identification of fritillariae cirrhosae bulbus by TLC

2.1.6 甘草的鑒別 取本品50 mL，加水飽和正丁醇100 mL振搖提取，分取正丁醇液，用水100 mL洗滌，棄去水層，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。取甘草陰性樣品50 mL，同法制成陰性對照溶液。另取甘草對照藥材1 g，加乙醚40 mL，水浴回流1 h，濾過，棄去乙醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL使溶解，自“加水飽和正丁醇100 mL振搖提取”起，同法制成對照藥材溶液。再取甘草苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(體積比15∶1∶1∶2)為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%(體積分?jǐn)?shù))H2SO4乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點清晰，在紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，見圖6。

123456789101112

1～9.供試品(170101～170107、170109、161104); 10.甘草陰性對照； 11.甘草對照藥材； 12.甘草苷對照品。

圖6甘草鑒定薄層色譜圖

Figure6TLC Charts for identification of glycyrrhizae Radix et rhizome

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)H3PO4溶液為流動相B，按表1梯度進行洗脫；流速為1 mL/min；甘草酸銨、柚皮苷的檢測波長分別為250、283 nm；柱溫為30 ℃；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫條件表Table 1 Gradient elution condition table

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 混合對照品儲備液的制備 精密稱取甘草酸銨對照品0.010 56 g，柚皮苷對照品0.043 41 g，置50 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為甘草酸銨、柚皮苷混合對照品儲備液(每1 mL含甘草酸銨0.192 4 mg，含柚皮苷0.818 7 mg)。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品5 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 分別取甘草、化橘紅陰性樣品各5 mL，同“2.2.2.2”項下方法制成甘草陰性、化橘紅陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品儲備液、供試品溶液與陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，結(jié)果見圖7～8。結(jié)果表明甘草、化橘紅陰性對照均無干擾，專屬性良好。

12BAC375325275225175125750?1031001101020304050607080900t/minU/mV

1.柚皮苷； 2.甘草酸銨; A.混合對照品儲備液； B.供試品溶液； C.化橘紅陰性對照溶液。

圖7化橘紅專屬性試驗(283 nm)HPLC色譜圖

Figure7HPLC of Citri grandis exocarpium specific test (283 nm)

BAC211001101020304050607080900t/min9080706050403020100?103U/mV

1.柚皮苷； 2.甘草酸銨; A.混合對照品儲備液； B.供試品溶液； C.甘草陰性對照溶液。

圖8甘草專屬性試驗(250 nm)HPLC色譜圖

Figure8HPLC of glycyrrhizae Radix et rhizome specific test (250 nm)

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密量取“2.2.2.1”項下的混合對照品儲備液適量，加甲醇制成每1 mL含甘草酸銨0.0196 4、0.096 22、0.192 43、0.384 87、0.481 08、0.589 25 mg，含柚皮苷0.081 87、0.409 36、0.818 71、1.637 43、2.046 78、2.456 14 mg的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定。以進樣量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程如下：Y(甘草酸銨)=9.459 221×102X+6.091 761 7×103(R=0.999 2)；Y(柚皮苷)=1.955 704 0×103X+5.057 006 09×104(R=0.999 2)。結(jié)果表明：甘草酸銨在19.64～589.25 ng、柚皮苷在81.87～2 456.14 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2.2”項下制備的供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次進行測定，結(jié)果甘草酸銨峰面積的RSD為0.2%，柚皮苷峰面積的RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 精密量取本品(批號：170101)5 mL，共6份，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果甘草酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.1%(n=6)；柚皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.9%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取本品適量(批號：170101)，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、8、16、36、48、72 h進樣，按“2.2.1”項色譜條件測定，結(jié)果甘草酸銨峰面積的RSD為1.2%，柚皮苷峰面積的RSD為0.3%，結(jié)果表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收試驗 取同一批復(fù)方川貝止咳糖漿(批號為170101，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.396 mg/mL，甘草酸為0.102 mg/mL)9份，每份精密量取2.5 mL，置20 mL量瓶中。再分別精密加入混合對照品儲備液0.6 mL共3份、1.3 mL共3份、2.0 mL共3份，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算甘草酸和柚皮苷的回收率。結(jié)果甘草酸的平均回收率為106.3%，RSD為1.1%(n=9)；柚皮苷的平均回收率為99.5%，RSD為0.9%(n=9)。結(jié)果見表2，表明方法準(zhǔn)確度較好。

2.2.9 樣品測定 分別取9批復(fù)方川貝止咳糖漿 5 mL，分別按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，每批平行測2份，結(jié)果見表3。

表2 復(fù)方川貝止咳糖漿加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 Recoveries of Compound Chuanbei cough syrup (n=9)

表3 9批復(fù)方川貝止咳糖漿中甘草酸、柚皮苷質(zhì)量濃度測定結(jié)果

Table3The contents of glycyrrhizic acid and naringin in Compound Chuanbei cough syrup (n=2)ρ/(mg·mL-1)

批號甘草酸柚皮苷1611040.10 0.41 1701010.10 0.40 1701020.10 0.42 1701030.09 0.41 1701040.09 0.41 1701050.10 0.42 1701060.10 0.41 1701070.11 0.43 1701090.09 0.41

3 討論

3.1 薄層鑒定條件的確定

研究表明，枇杷葉中主要含三萜酸類化學(xué)成分熊果酸和齊墩果酸[15]，而熊果酸和齊墩果酸為物理、化學(xué)性質(zhì)極為相近的同分異構(gòu)體，常同時存在[6]。故在建立枇杷葉的薄層鑒別中，盡量建立同時檢測熊果酸和齊墩果酸的方法?？疾熘邪l(fā)現(xiàn)：展開前薄層板不浸入1%碘-二氯甲烷溶液，薄層色譜中的熊果酸和齊墩果酸斑點Rf值幾乎相同；而薄層板展開前浸入1%碘-二氯甲烷溶液，熊果酸和齊墩果酸斑點能得到很好的分離，若樣品中同時存在熊果酸和齊墩果酸，使用該方法兩者均可檢出。

川貝母的薄層色譜鑒別中，曾設(shè)計了以貝母素乙與西貝母堿作為研究對象，比較以①石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯-濃氨試液(體積比9∶14∶1.5，下同)的上層溶液和以②石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(9∶14)(樣品置用濃氨試液預(yù)飽和的展開缸內(nèi)展開)的展開系統(tǒng)，結(jié)果以①為展開劑時，貝母素乙與西貝母堿的Rf值適中，且分離度較好；以②為展開劑時，貝母素乙與西貝母堿的Rf值幾乎相同，難以分離。故本試驗采用①作為展開系統(tǒng)。

3.2 檢測波長的選擇

分別取甘草酸銨、柚皮苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL各含甘草酸銨、柚皮苷0.1 mg的溶液，在波長190～400 nm間掃描，結(jié)果甘草酸銨在(250±2) nm處有最大吸收，柚皮苷在(283±2) nm處有最大吸收，故選用甘草酸銨、柚皮苷的檢測波長分別為250、283 nm。

3.3 耐用性考察

使用本文檢測方法，考察了不同儀器(日本島津LC-2010AHT高效液相色譜儀、日本島津LC-20AT高效液相色譜儀)、不同色譜柱[(Aglient Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、SHISEIDO MGⅡ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和InertSustain C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)]、不同柱溫(20～40 ℃)下的檢測結(jié)果，結(jié)果均能得到較好重現(xiàn)。