李然，李靜，童巧珍，徐長(zhǎng)瓊，唐奇，夏麗瓊，黃妍君，李旭富，黎春輝

(1．岳陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 岳陽(yáng) 414000； 2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 4.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041； 5.北京同仁堂平江白術(shù)有限公司，湖南 岳陽(yáng) 414000)

白術(shù)藥材為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，又名“冬術(shù)”“浙術(shù)”“于術(shù)”，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，可用于治療脾虛食少、腹脹腹瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安[1]，主產(chǎn)于湖南、浙江、安徽、湖北、江西、四川等地。產(chǎn)于湖南平江縣者，稱為“平江白術(shù)”，俗稱“平術(shù)”，平江白術(shù)有400多年的種植歷史，早在明朝嘉靖年間，《本草綱目》中即有云：“白術(shù)瘦而黃者是幕阜山所出”，幕阜山位于今湖南省岳陽(yáng)市平江縣。清代同治《平江縣志》物產(chǎn)篇盛贊“平術(shù)最著名”，因平江白術(shù)品質(zhì)較佳，在國(guó)內(nèi)外藥材市場(chǎng)享有盛譽(yù)。

目前，關(guān)于平江白術(shù)的研究多集中在栽培技術(shù)方面，如朱校奇等[2]制定了栽培技術(shù)規(guī)程，宋英等[3]闡述了連作障礙的原因及其消除途徑，但未見(jiàn)平江白術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)相關(guān)報(bào)道。白術(shù)的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、內(nèi)酯類、苷類、多糖類、氨基酸等成分，而白術(shù)揮發(fā)油為其抗癌[4]、修復(fù)胃黏膜[5]、抑菌[6]等多重藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)擬在用GC-MS法對(duì)平江白術(shù)揮發(fā)油成分鑒定分析的基礎(chǔ)上，建立道地藥材平江白術(shù)揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

DFT-200型手提式高速萬(wàn)能粉粹機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；BSA224S-CW型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；揮發(fā)油提取器；98-I-B型電子調(diào)溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司)；7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫公司)。

15批平江白術(shù)樣品分別于湖南省平江縣龍門鎮(zhèn)、長(zhǎng)壽鎮(zhèn)、加義鎮(zhèn)、平江縣城、北京同仁堂等進(jìn)行收集，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院童巧珍教授鑒定為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，具體來(lái)源情況見(jiàn)表1。蒼術(shù)酮對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)180621，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%)；無(wú)水Na2SO4(廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)20171120，分析純)；三氯甲烷(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20160202-2，分析純)。

表1 15批平江白術(shù)樣品來(lái)源信息

Table1Samples source information of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

編號(hào)來(lái)源編號(hào)來(lái)源S1平江龍門鎮(zhèn)新和村S9平江加義鎮(zhèn)楊林街村S2平江龍門鎮(zhèn)純良村S10平江加義鎮(zhèn)麗江村S3平江龍門鎮(zhèn)源里村S11平江加義鎮(zhèn)楊林街村S4平江龍門鎮(zhèn)大漁村S12平江長(zhǎng)壽鎮(zhèn)白沿村S5平江龍門鎮(zhèn)豐福村S13平江縣城S6平江龍門鎮(zhèn)福壽村S14平江縣城S7S8平江龍門鎮(zhèn)河仙村平江龍門鎮(zhèn)渣平村S15北京同仁堂平江白術(shù)有限公司

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取蒼術(shù)酮對(duì)照品適量，精密稱定，置2 mL容量瓶中，加入三氯甲烷溶解，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取15批平江白術(shù)藥材，各100 g，敲碎，再用粉碎機(jī)打碎，過(guò)2號(hào)篩。置1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，浸泡3 h，參照2015年版《中國(guó)藥典》“揮發(fā)油測(cè)定法”提取平江白術(shù)揮發(fā)油。連續(xù)提取5 h，得油狀物，冷卻放置2 h后，讀數(shù)并收集揮發(fā)油，加適量無(wú)水Na2SO4脫水。取揮發(fā)油20 μL，至2 mL棕色量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 GC-MS條件

2.3.1 氣相色譜條件 HP-5 MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛細(xì)管柱，程序升溫：柱初始溫度為100 ℃，以3 ℃/min升至130 ℃，保留10 min，再以6 ℃/min升至250 ℃。進(jìn)樣量為0.1 μL；分流比為50∶1；氣化室溫度為250 ℃；載氣為高純度He(99.999%)。

2.3.2 質(zhì)譜條件 EI離子源；離子源溫度為230 ℃；電離能量為70 eV；四極桿溫度為150 ℃；EM電壓2 165 V；接口溫度為280 ℃；溶劑延遲3 min；掃描質(zhì)量范圍m/z40～550。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取S15供試品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取0.1 μL，按“2.3”項(xiàng)下GC-MS條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004年A版)”(簡(jiǎn)稱“相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”)計(jì)算相似度，結(jié)果均為1.000，其中共有峰的相對(duì)峰面積的RSD值均<2.00%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取S15供試品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣0.1 μL，所得圖譜運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算相似度，結(jié)果均為1.000，其中共有峰的相對(duì)峰面積的RSD值均<2.00%，表明各樣品成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性考察 取S15供試品，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，并按“2.3”項(xiàng)下條件分析，所得圖譜運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算相似度，結(jié)果均為1.000，其中共有峰相對(duì)峰面積的RSD均<2.00%(范圍：0.00%～0.62%)，表明本方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.5 指紋圖譜的建立及共有峰的鑒定

按“2.3”項(xiàng)下GC-MS條件，對(duì)15批平江白術(shù)供試品揮發(fā)油進(jìn)行分析，測(cè)得GC-MS總離子流圖。將積分后圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行處理分析，建立平江白術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜共有模式，見(jiàn)圖1。各批平江白術(shù)揮發(fā)油總離子流圖疊加圖見(jiàn)圖2。

1.280.960.640.320?107豐度12182430364206t/min1.蒼術(shù)酮。1.280.960.640.320?107豐度12182430364206AB11

圖115批平江白術(shù)藥材GC-MS指紋圖譜共有模式(A)及對(duì)照品(B)圖譜

Figure1The maps of GC-MS fingerprint common pattern of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang (A)and the reference(B)

在平江白術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜中，共標(biāo)定出17個(gè)共有指紋峰，其中16號(hào)峰(蒼術(shù)酮)為對(duì)照，其他16個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間依次為0.434、0.443、0.452、0.462、0.471、0.491、0.513、0.544、0.598、0.659、0.686、0.709、0.730、0.750、0.910、1.690，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.20%(范圍：0.00%～0.12%)；17個(gè)共有指紋峰的總面積占GC-MS檢出的平江白術(shù)揮發(fā)油總峰面積的90%以上。

通過(guò)NIST14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7]，分析平江白術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜中共有峰成分，分析結(jié)果見(jiàn)表2。

1.280.960.640.320?107豐度12182430364206t/minS15S1

S1～S15. 表1中S1-S15樣品。

圖215批平江白術(shù)供試品的GC-MS指紋圖譜疊加圖

Figure2The Overlay map of GC-MS fingerprint of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

2.6 相似度分析

將15批平江白術(shù)指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，以共有模式圖譜為對(duì)照，計(jì)算各批白術(shù)揮發(fā)油圖譜與共有模式圖譜的相似度，結(jié)果15批白術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜與共有模式對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.999、0.989、0.999、1.000、0.999、1.000、1.000、0.999、0.999、1.000、0.921、0.998、1.000、0.994、0.999。有93.33%的供試品相似度在0.980以上，其中相似度最低者為S11，可見(jiàn)平江白術(shù)化學(xué)成分相似度較高，但質(zhì)量存在一定差異。

2.7 聚類分析

以17個(gè)共有峰峰面積為變量，運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)15批平江白術(shù)樣品進(jìn)行聚類分析，采用組間鏈接，以值向量的余弦作為樣品相似度的測(cè)度，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)分類距離為5時(shí)，可分為2類，供試品S8、S15、S5、S10、S13、S12、S1、S9、S6、S7、S3、S4、S2、S14為一類，S11為一類，聚類趨勢(shì)與相似度結(jié)果基本一致，二者分析結(jié)果可相互驗(yàn)證。

2.8 主成分分析

運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)17個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)主成分分析，得到相關(guān)特征值及其方差，見(jiàn)表3。根據(jù)特征值與方差累積貢獻(xiàn)率，共提取了5個(gè)主成分，方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)89.323%，可代表平江白術(shù)藥材指紋圖譜共有峰的大部分信息。

表2 平江白術(shù)揮發(fā)油共有成分分析Table 2 Analysis of common components in the essential oil of Atractylodes macrocephala Koidz. produced in Pingjiang

S8S15S5S10S13S12S1S9S6S7S3S4S2S14S111015202505

圖315批平江白術(shù)藥材聚類分析樹狀圖

Figure3Cluster analysis dendrogram of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

表3 平江白術(shù)中17個(gè)共有峰的主成分特征值及方差

Table3Principal component eigenvalues and variances of 17 common peaks ofAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

主成分特征值方差貢獻(xiàn)率/%方差累積貢獻(xiàn)率/%16.35037.35637.35623.52220.71758.07332.37713.98072.05341.6509.70381.75751.2867.56689.323

主成分載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小和作用方向。17個(gè)共有峰對(duì)5個(gè)主成分影響的得分圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，除共有峰7、11、13、16、17對(duì)主成分1呈負(fù)相關(guān)，其余均為正相關(guān)，其中共有峰1、2、4、5、6、8、9、10、12對(duì)主成分1的貢獻(xiàn)最大；17個(gè)變量對(duì)主成分2多為正相關(guān)，共有峰3、7、8、11、13、14、16、17對(duì)主成分2貢獻(xiàn)最大，其中共有峰5、7、11、17與主成分2呈負(fù)相關(guān)；共有峰10、12、14、15對(duì)主成分3貢獻(xiàn)最大；共有峰7、11、13、17對(duì)主成分4貢獻(xiàn)最大；共有峰3對(duì)主成分5貢獻(xiàn)最大，且與主成分5呈負(fù)相關(guān)。

進(jìn)一步將各特征向量中心化和標(biāo)準(zhǔn)化后，15批平江白術(shù)樣品的主成分排序坐標(biāo)圖見(jiàn)圖5。由圖5可知，第1主成分得分最高的為S2，第2主成分得分最高的為S5，第3主成分得分最高的為S14，第4主成分得分最高的為S11，第5主成分得分最高的為S7。以第1、2、3主成分得分做三維散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖6?？蓪?5批平江白術(shù)分為3類，其中S1、S2、S5、S6、S8、S10、S12、S14聚為一類，S3、S4、S7、S9、S13、S15聚為一類，S11聚為一類，此結(jié)果與相似度分析、聚類分析基本一致。

圖4平江白術(shù)中共有峰5個(gè)主成分得分圖

Figure4The map of 5 principal component scores of common peaks inAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

圖515批平江白術(shù)中5個(gè)主成分的排序坐標(biāo)圖

Figure5The sorting graph of five principal components of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

主成分2主成分11.00.50.0-0.5-1.0-1.0-0.50.00.51.01.00.50.0-0.5-1.0主成分3

圖6主成分得分三維散點(diǎn)圖

Figure6Principal component score three-dimensional scatter map

3 討論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用2015年版《中國(guó)藥典》中的揮發(fā)油提取方法，提取了15批平江白術(shù)的揮發(fā)油。通過(guò)對(duì)色譜圖的出峰數(shù)量、各峰分離度與豐度為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試條件考察，最終確定目前所用測(cè)試條件。方法學(xué)考察表明，使用該方法確定的平江白術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜準(zhǔn)確可靠，為評(píng)價(jià)平江白術(shù)質(zhì)量提供重要參考。

不同批次平江白術(shù)中均含蒼術(shù)酮等17種成分，占藥材揮發(fā)性成分的90%以上，具顯著代表性，故以此17種成分建立平江白術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜。但以上17種成分的種類和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是否為平江白術(shù)的特征，仍需與更大樣本量的非平江產(chǎn)白術(shù)進(jìn)一步分析比較。

本試驗(yàn)初步確立了平江白術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的分析方法，建立了平江白術(shù)指紋圖譜。該方法簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)，可初步用于平江白術(shù)藥材的鑒定，為平江白術(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。