唐文誠(chéng)，李 敏，易輝燕，羅芳芳，楊 麗

（綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院·四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽(yáng) 621000）

抑郁癥是一種臨床常見的、嚴(yán)重危害人類身心健康的精神疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可由各種原因引起，其發(fā)病率和自殺率均較高，患者的心理社會(huì)功能受損明顯［1］。細(xì)胞因子作為能在細(xì)胞之間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的一類蛋白質(zhì)或小分子多肽，其在抑郁癥中的作用已引起越來越多研究者的重視［2］。Smith［3］于 90年代提出細(xì)胞因子假說，認(rèn)為抑郁癥及抑郁相關(guān)癥狀與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素 -γ（interferon-γ，INF-γ）以及白介素1（interleukin-1，IL-1）等細(xì)胞因子的過度分泌有關(guān)。而細(xì)胞因子的過度分泌與體內(nèi)氧化應(yīng)激密切相關(guān)，有研究顯示，雙相情感障礙患者發(fā)作期的氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡，這可能會(huì)引發(fā)雙相情感障礙的某些臨床特征［4］。慢性應(yīng)激反應(yīng)可改變體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和激素的釋放、炎性因子的產(chǎn)生以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)，導(dǎo)致海馬組織內(nèi)神經(jīng)再生障礙，使學(xué)習(xí)功能減退，誘發(fā)抑郁癥［5-6］。抑郁癥患者常有心境低落、思維遲緩、意志活動(dòng)減退等癥狀，學(xué)習(xí)、記憶和工作能力均有不同程度的下降，而海馬神經(jīng)元與學(xué)習(xí)、記憶功能密切相關(guān)［7-9］。由于炎性細(xì)胞因子作用的重要靶點(diǎn)之一是海馬組織，故炎癥-細(xì)胞因子假說也被很多學(xué)者關(guān)注［10］。有研究顯示，非甾體抗炎藥如美洛昔康、尼美舒利有一定的抗抑郁作用［11-13］。阿司匹林作為經(jīng)典的非甾體抗炎藥物，可作用于細(xì)胞因子而發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓等作用［14］，但目前阿司匹林單獨(dú)用于抗抑郁治療及其抗抑郁機(jī)制的相關(guān)研究較少，本研究通過觀察阿司匹林對(duì)慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（chironic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁模型大鼠海馬組織內(nèi)細(xì)胞因子的影響，探討阿司匹林的抗抑郁作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性 SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。進(jìn)行晝夜時(shí)間比為 1∶1（12 h／12 h）的循環(huán)飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度（25±2）℃、濕度（65±20）%，食物與水充分供給，自由攝取。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始試驗(yàn)。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審核通過，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用原則。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品

阿司匹林，購(gòu)于辰欣藥業(yè)股份有限公司；0.9%氯化鈉注射液，購(gòu)于四川科倫藥業(yè)股份有限公司；TNF-α試劑盒、白介素10（interleukin-10，IL-10）試劑盒、白介素6（interleukin-6，IL-6）試劑盒、白介素4（interleukin-4，IL-4）試劑盒、白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒，均購(gòu)于福建海韻生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為測(cè)試儀、高架十字迷宮測(cè)試儀、強(qiáng)迫游泳行為測(cè)試儀，均由重慶醫(yī)科大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室制。MDF-U3386S型-80℃超低溫冰箱購(gòu)自日本SANYO公司，iMark550型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，JM-B30002電子天平購(gòu)自諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將30只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用曠場(chǎng)試驗(yàn)對(duì)大鼠行為進(jìn)行評(píng)定，然后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和阿司匹林組各10只。正常組繼續(xù)在原條件下飼養(yǎng)，模型組和阿司匹林組單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 CUMS抑郁模型建立

參考汪燕等［15-17］研究方法，采用慢性不可預(yù)見性刺激結(jié)合孤養(yǎng)方式建立抑郁大鼠模型。除正常組外，模型組和阿司匹林組均接受為期21 d的不同刺激。刺激方法包括：4℃冰水游泳5 min、45℃熱刺激5 min、鼠籠45°傾斜24 h、異味刺激24 h、禁食24 h、禁水24 h、夾尾巴1 min、潮濕墊料24 h、晝夜顛倒12 h／12 h。每天隨機(jī)選擇1種方法對(duì)大鼠進(jìn)行刺激，每種刺激方法不超過3次且同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)。

1.2.3干預(yù)方法

于建模成功后對(duì)3組大鼠開始灌胃，灌胃時(shí)間為每天8∶00-9∶00，每次灌胃量均為2 mL，每日1次，連續(xù)灌胃21 d。阿司匹林組給藥方法：阿司匹林3 mg／（kg·d），用 0.9%氯化鈉注射液配制成0.3 mg／mL的藥液；正常組和模型組均給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.2.4 行為及療效評(píng)定

對(duì)模型組和阿司匹林組大鼠連續(xù)21 d進(jìn)行CUMS后，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)定大鼠行為以判斷建模是否成功。對(duì)3組大鼠灌胃21 d后，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)定療效。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)主要是觀察大鼠5 min內(nèi)的水平和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)，用于評(píng)定大鼠的運(yùn)動(dòng)和探索行為能力。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)主要是觀察大鼠6 min內(nèi)的攀爬、游泳、潛水次數(shù)和不動(dòng)時(shí)間，本研究?jī)H觀察大鼠的不動(dòng)時(shí)間，用于評(píng)定藥物是否具有抗抑郁作用。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)主要是觀察大鼠5 min內(nèi)進(jìn)入開放臂次數(shù)（OE）、進(jìn)入開放臂時(shí)間百分比（OT%）及進(jìn)入高架十字迷宮總次數(shù)（OE+CE），用于評(píng)定大鼠的焦慮或抑郁程度。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的具體操作方法和步驟按相關(guān)文獻(xiàn)［12-13］進(jìn)行。

1.2.5 細(xì)胞因子檢測(cè)

運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）的生物素雙抗體夾心法測(cè)定大鼠 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10及 TNF-α水平。根據(jù)說明書及相關(guān)文獻(xiàn)［9，13］的步驟和方法進(jìn)行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)吸光度（OD）值，先計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

用Excel 2013錄入并整理數(shù)據(jù)，采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（x—±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett’s t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 CUMS前三組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

CUMS前，三組大鼠的水平和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 CUMS前三組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（x—±s，次）

2.2 CUMS后三組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

建模后，與正常組相比，模型組、阿司匹林組大鼠的水平和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 CUMS后三組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（x—±s，次）

2.3 干預(yù)后三組大鼠行為指標(biāo)比較

干預(yù)后，三組大鼠的水平與垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)、不動(dòng)時(shí)間、OE及（OE+CE）次數(shù)、OT%值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，模型組水平運(yùn)動(dòng)與垂直運(yùn)動(dòng)、OE及（OE+CE）次數(shù)均少于正常組，OT%值低于正常組，不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。阿司匹林組水平運(yùn)動(dòng)與垂直運(yùn)動(dòng)、OE及（OE+CE）次數(shù)均多于模型組，OT%值高于模型組，不動(dòng)時(shí)間短于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。見表3。

2.4 干預(yù)后三組大鼠海馬組織內(nèi)細(xì)胞因子水平比較

干預(yù)后，三組大鼠海馬組織的IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，模型組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于正常組，IL-4水平低于正常組（P＜0.05或0.01）；正常組與模型組IL-10水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。阿司匹林組大鼠IL-10水平高于模型組，IL-6和TNF-α水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），阿司匹林組與模型組大鼠IL-4、IL-1β水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表4。

表3 干預(yù)后三組大鼠行為指標(biāo)比較（x—±s）

表4 干預(yù)后三組大鼠海馬組織內(nèi)細(xì)胞因子水平比較（x—±s，ng／L）

3 討 論

抑郁癥是一種常見的慢性心理疾病，長(zhǎng)時(shí)間的慢性壓力是其發(fā)病的主要誘因［18］。CUMS通過改變外部環(huán)境使大鼠產(chǎn)生異常行為，從而建立抑郁模型，該模型能模擬人類抑郁的核心癥狀（如對(duì)愉悅事件的反應(yīng)），更接近人類抑郁癥的各種癥狀［15］，是一種經(jīng)典的抑郁建模方法。

本研究采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)方式建立大鼠抑郁模型。對(duì)大鼠連續(xù)21 d進(jìn)行CUMS后，模型組和阿司匹林組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均少于正常組（P均＜0.05），說明模型組和阿司匹林組大鼠的活動(dòng)度、對(duì)新鮮環(huán)境的探索能力降低，快感缺乏。提示CUMS致大鼠出現(xiàn)抑郁行為，建模成功，與Lu等［19-21］研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后，阿司匹林組大鼠的水平、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均多于模型組，水平運(yùn)動(dòng)反映動(dòng)物的活動(dòng)度，垂直運(yùn)動(dòng)反映動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的好奇度［20］，提示經(jīng)阿司匹林灌胃后，大鼠的活躍度增強(qiáng)，探索能力提高。水中不動(dòng)時(shí)間反映藥物是否具有抗抑郁作用［17，22］，本研究中，阿司匹林組大鼠的不動(dòng)時(shí)間短于模型組，提示阿司匹林具有一定抗抑郁作用。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后，阿司匹林組大鼠的OE、（OE+CE）次數(shù)均多于模型組，OT%值高于模型組，提示經(jīng)阿司匹林灌胃后，大鼠的抑郁或焦慮程度減輕。

細(xì)胞因子可分為前炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和抗炎性細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）。有研究顯示，細(xì)胞因子在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，前炎性細(xì)胞因子與抑郁癥的發(fā)病相關(guān)，而抗炎性細(xì)胞因子與抗抑郁療效相關(guān)［5，23］。有研究發(fā)現(xiàn)，在抑郁癥患者的血液和腦脊液中均伴有IL-1β、IL-6、TNF-α水平的升高，而抗抑郁藥物的療效與IL-4、IL-10水平的下降有關(guān)［23］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織的IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于正常組，而IL-4水平低于正常組，提示抑郁癥的發(fā)生可能與細(xì)胞因子水平異常有關(guān)，與以往研究結(jié)果一致。干預(yù)后，阿司匹林組大鼠IL-10水平高于模型組，IL-6及TNF-α水平均低于模型組，提示阿司匹林的抗抑郁作用可能與抑制前炎性細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α）的釋放及促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子（IL-10）的釋放有關(guān)，與鐘家菊等［2，24］研究結(jié)果一致。

綜上所述，阿司匹林可改善抑郁模型大鼠的抑郁行為，其可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子發(fā)揮抗抑郁作用，為探索非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥的抗抑郁作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究存在一定的局限性，首先，樣本量較小，今后的研究建議擴(kuò)大樣本量以進(jìn)一步驗(yàn)證阿司匹林的抗抑郁效果；其次，未從蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等方面進(jìn)行更深入的研究。