張誼微 石 晶 劉宇鵬 曹麗明 胡付蘭 趙亞雙

大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一。2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，大腸癌新發(fā)病例超過180萬，因大腸癌死亡的病例約88萬。全球范圍內(nèi)大腸癌發(fā)病率居第三位，死亡率居第二位[1]。中國大腸癌發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[2]，嚴重威脅居民健康。大腸癌可由于基因突變、表觀遺傳修飾的改變和環(huán)境暴露的積累而發(fā)生。在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，通?？梢詸z測到基因啟動子區(qū)高甲基化，并誘導(dǎo)基因沉默。DNA甲基化可以作為大腸癌診斷、治療和預(yù)后的標志物。

去泛素化特異性調(diào)節(jié)酶1(Ubiquitin specific peptidase 1，USP1)是具有重要DNA修復(fù)功能的基因，在人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[3]。多數(shù)腫瘤中均可以檢測到USP1水平升高，如宮頸癌、乳腺癌、胃癌、黑色素瘤和肉瘤等[4]。同時發(fā)現(xiàn)USP1還可以促進乳腺癌轉(zhuǎn)移[5]。然而，關(guān)于USP1在腫瘤中異常表達的潛在分子學(xué)機制尚不清楚，USP1甲基化與腫瘤預(yù)后之間的關(guān)系也仍然未知。DNA甲基化改變不僅可以在腫瘤組織中檢測到，也可以在外周血中檢測到[6]。對外周血中DNA甲基化改變的研究有助于了解腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，為腫瘤靶向治療提供理論依據(jù)。因此，我們進行了隊列研究，以研究外周血USP1甲基化及臨床病理特征與大腸癌預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

該研究采用隊列研究。將哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院確診的大腸癌患者(2004年11月—2007年12月)納入為研究對象，納入病例均為術(shù)后臨床病理診斷的原發(fā)性新發(fā)大腸癌患者。

1.2 資料收集

1.2.1 樣本采集 獲取患者的知情同意后，對每位研究對象抽取約5 mL外周靜脈血，EDTA抗凝，離心處理后，分裝至200 μL/500 μL離心管中，于-80℃凍存。

1.2.2 數(shù)據(jù)采集 (1)收集內(nèi)容：人口統(tǒng)計學(xué)特征，包括年齡、性別、籍貫、婚姻狀況、職業(yè)、文化程度等；患者術(shù)后病理資料，包括腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況、腫瘤UICC分期、分化程度、組織學(xué)分型、術(shù)前CEA和CA19-9水平等以及術(shù)后放化療的情況；(2)病例隨訪：以診斷日期為隨訪開始時間，每年進行一次電話隨訪，并排除術(shù)前放化療、術(shù)后30天內(nèi)死亡病例，隨訪終點為2014年3月15日。隨訪內(nèi)容主要包括大腸癌患者生存情況(是否存活、死亡時間及原因等)，術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況和術(shù)后放化療情況等。

1.3 DNA提取和重亞硫酸氫鹽修飾

使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)從血液樣品中提取外周血DNA。使用Qiagen EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen，德國)用于DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。使用Nanodrop 2000微量核酸測定儀(Thermo，美國)檢測DNA質(zhì)量和濃度。所有步驟均根據(jù)產(chǎn)品說明書進行操作。

1.4 USP1甲基化分析

使用LightCycler?480 High Resolution Melting Master mix試劑盒(Roche，瑞士)，通過甲基化敏感高分辨率熔解曲線分析法(MS-HRM)檢測和分析USP1的甲基化水平。

引物設(shè)計使用Primer Premier 5.0：正向引物，5′-GCGAGACGGTTTTTTTTTTT-3′；反向引物，5′-GTCGCACACACAACCCAAATA-3′。PCR擴增片段位于1號染色體(62901593-62901710，118 bp)。PCR擴增反應(yīng)體系(5 μL)：Mix試劑2.5 μL，MgCl2溶液(25 mM)0.6 μL，去離子水1.2 μL，正向和反向引物(10 μM)各0.1 μL，重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA 0.5 μL。HRM檢測條件：PCR反應(yīng)進行60個循環(huán)，梯度退火55～53℃12秒，熔解溫度65～95℃。

使用重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的完全未甲基化(無甲基化)和完全甲基化(100%甲基化)DNA構(gòu)建一系列甲基化標準品系列，包括0、0.5%、1%、2%和100%。使用無模板雙蒸水作為空白對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，應(yīng)用Cox比例風(fēng)險模型分析基因甲基化與大腸癌預(yù)后的關(guān)系，缺失超過10%且低于20%的變量采用多重插補法填補，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共隨訪286名大腸癌患者。隨訪結(jié)束時40.6%(116/286)的患者死亡，47.6%的患者(136/286)存活和11.8%(34/286)的患者失訪。隨訪患者的平均年齡為59.1±11.6歲，小于60歲年齡組人數(shù)占51.1%(146/286)，超過60歲年齡組人數(shù)占48.9%(140/286)，男女比例約為1.5∶1(173/113)(表1)。

2.2 臨床病理特征與大腸癌預(yù)后的關(guān)系

臨床特征與大腸癌預(yù)后風(fēng)險的單因素Cox分析結(jié)果顯示，UICC腫瘤4期(HR=2.429，95%CI：1.237～4.773，P=0.010)、腫瘤大小超過50 mm(HR=1.550，95%CI：1.039～2.311，P=0.032)和組織學(xué)非腺型(HR=3.522，95%CI：1.113～11.147，P=0.032)與大腸癌預(yù)后有關(guān)(表1)。

將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義，以及曾有研究顯示對大腸癌預(yù)后有影響的變量納入多因素Cox回歸分析中。納入變量包括UICC分期、病理分型、分化程度、腫瘤大小、組織學(xué)分型、術(shù)前CEA水平、術(shù)前CA19-9水平和術(shù)后放療情況。結(jié)果如表2所示，與單因素分析結(jié)果相一致，UICC腫瘤分期、腫瘤大小超過50 mm和組織學(xué)非腺型與大腸癌患者的預(yù)后不良風(fēng)險增加之間有關(guān)，而其它病理特征與大腸癌預(yù)后不良風(fēng)險之間無關(guān)。

表1 大腸癌患者臨床病理特征與生存預(yù)后的單因素分析

表2 大腸癌患者臨床特征和生存預(yù)后的多因素分析結(jié)果

2.3 USP1甲基化和大腸癌預(yù)后風(fēng)險的關(guān)系

檢測發(fā)現(xiàn)USP1甲基化的病例為92例，甲基化水平均低于0.5%。調(diào)整年齡、性別、UICC分期、組織學(xué)分型和腫瘤大小后，USP1基因甲基化和大腸癌患者的預(yù)后無統(tǒng)計學(xué)意義(HRa=1.229，95%CI：0.792～1.906，P=0.358)(表3)。

2.4 USP1甲基化和大腸癌預(yù)后風(fēng)險的亞組分析

根據(jù)年齡是否超過60歲、性別和腫瘤部位進行亞組分析UPS1基因甲基化與大腸癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，USP1基因甲基化與男性大腸癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計學(xué)意義(HRc=2.027，95%CI：1.226～3.351，P=0.006)，調(diào)整年齡、UICC分期、組織學(xué)分型和腫瘤大小后仍有統(tǒng)計學(xué)意義(HRa=2.091，95%CI：1.195～3.661，P=0.010)。在不同年齡組和腫瘤部位的亞組分析中，調(diào)整前后，USP1甲基化與結(jié)腸癌預(yù)后風(fēng)險的關(guān)系均無統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

表3 USP1甲基化與大腸癌預(yù)后風(fēng)險的關(guān)系

Note：HRcwas crudeHR；HRawas adjusted for age，gender，UICC stages，histological types and tumor size.

表4 USP1基因甲基化與大腸癌預(yù)后的亞組分析結(jié)果

Note：HRcwas crudeHR；HRawas adjusted for age，gender，UICC stages，histological types and tumor size.

3 討論

大腸癌的預(yù)后與臨床病理特征、術(shù)后放化療等因素有關(guān)，本研究結(jié)果顯示UICC腫瘤分期4期、腫瘤大小超過50 mm和組織學(xué)分型為非腺型會增加大腸癌預(yù)后不良的風(fēng)險。在男性病例中，調(diào)整年齡、UICC分期、組織學(xué)分型和腫瘤大小后，USP1基因甲基化的大腸癌預(yù)后不良的風(fēng)險是USP1基因未甲基化的2.027倍。多項研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中某些分子學(xué)變化也與其預(yù)后有關(guān)，DNA甲基化可以作為大腸癌治療和預(yù)后的標志物。研究顯示，大腸癌中存在多基因啟動子區(qū)異常甲基化的現(xiàn)象，而發(fā)生異常甲基化的基因多具有細胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、細胞凋亡、血管生成、侵襲和粘附功能[7]。USP1是范可尼貧血(Fanconi anemia，F(xiàn)A)通路相關(guān)基因，具有重要DNA修復(fù)功能，是FA通路修復(fù)DNA損傷過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。目前，許多化學(xué)治療藥物通過使癌細胞產(chǎn)生廣泛DNA損傷來靶向針對癌細胞DNA復(fù)制。癌細胞為消除基因毒性效應(yīng)并使其繼續(xù)不受控制增殖，經(jīng)常重新激活自身DNA修復(fù)機制。因此，本研究結(jié)果也為腫瘤靶向治療提供了新方向和理論依據(jù)。

USP1作為DNA修復(fù)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要在FA通路調(diào)節(jié)FANCD2泛素化和轉(zhuǎn)移損傷DNA合成(TLS)過程中調(diào)節(jié)PCNA泛素化[8]。USP1過表達可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)泛素化和去泛素化失衡，促進細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲，并降低細胞化學(xué)敏感性[9]。此外，USP1基因過表達還會導(dǎo)致DNA結(jié)合蛋白抑制劑(IDs)累積，直接或間接參與了中心體復(fù)制的調(diào)控，誘導(dǎo)中心體異常和染色體不穩(wěn)定等[10]，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。在多種腫瘤中，包括大腸癌，均發(fā)現(xiàn)了異常的USP1過表達現(xiàn)象[5]，然而其表達上調(diào)與腫瘤病人預(yù)后的關(guān)系仍不清楚。

本研究結(jié)果顯示，在男性大腸癌患者中，發(fā)現(xiàn)USP1甲基化與大腸癌預(yù)后關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計學(xué)意義。雖然基因啟動子區(qū)甲基化通常會導(dǎo)致基因沉默[11]，但仍然有研究表明，一些基因高甲基化與其過表達有關(guān)。例如，在急性髓性白血病(AML)中，AWT1基因過表達-高甲基化可作為一種特征性標志物。MMP9基因高甲基化也與其過度表達有關(guān)，并在腫瘤發(fā)生和進展中起作用[12]?；蝮w甲基化(如外顯子、內(nèi)含子和增強子)可能影響轉(zhuǎn)錄延伸、基因激活和某些可變剪接，基因啟動子區(qū)的表觀遺傳改變可能影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而轉(zhuǎn)錄水平又可能受到其他順式增強子元件的調(diào)控，增強基因表達[13]?；谏鲜黾僭O(shè)，雖然本研究未探討USP1甲基化與表達之間的直接關(guān)聯(lián)，但USP1甲基化可能是表達上調(diào)的一種分子機制。此外，飲食和生活方式在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮重要作用，三分之一的癌癥患者死亡可能由不適當(dāng)?shù)娘嬍澈蜕罘绞綄?dǎo)致[14]，而不同性別的人群，其飲食和生活方式均有所不同，同時，本研究結(jié)果還可能受到納入研究隊列的樣本量的限制。因此，關(guān)于USP1基因甲基化能否確認為大腸癌預(yù)后標志物的問題還需要進一步研究。

本研究首次探討了USP1基因甲基化與大腸癌預(yù)后之間的關(guān)系，存在一定局限性，約10%的患者存在失訪，且病例隨訪結(jié)束時間為2014年，未繼續(xù)隨訪。