宋 玲 付 瓊

卵巢癌(Ovarian cancer，OC)是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]。近年來，化療耐藥成為困擾婦科腫瘤醫(yī)生的重要難題，因此，發(fā)掘新的抗腫瘤藥物具有重要的臨床意義。Warburg效應是導致腫瘤化療耐藥的重要因素之一，大多數(shù)腫瘤細胞即使在氧含量正常的條件下，也高表達缺氧誘導因子(Hypoxia inducible factor，HIF)，促進糖酵解代謝以及一系列促增殖和侵襲的信號通路激活，其中HIF-1α是最重要的HIF活性亞基[2]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)了一種新型抗卵巢癌細胞單體藥物紫云英苷(Astragaline，ATG)，可通過下調(diào)HIF-1α蛋白表達抑制糖酵解途徑進而發(fā)揮抑制卵巢癌細胞增殖和遷移的作用[3]，但其作用機制尚未完全闡明。因此，本研究通過缺氧培養(yǎng)卵巢癌細胞，并采用ATG聯(lián)合脯氨酸羥化酶-2(Prolyl-4-hydroxylase-2，PHD2)的抑制劑IOX2干預卵巢癌細胞，在體外細胞水平探討ATG抑制HIF-1α蛋白表達的作用及其分子機制，初步探索ATG與卵巢癌化療藥物的聯(lián)合作用，為抗卵巢癌新藥發(fā)現(xiàn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)、處理及分組

人卵巢癌OVCAR-8和SK-OV-3細胞均培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL)中，置于培養(yǎng)條件為21%O2、5% CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞缺氧處理置于1%O2、5% CO2、94%N2、37℃的三氣恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組OVCAR-8和SK-OV-3細胞處理方式為：空白對照組細胞僅進行缺氧培養(yǎng)24 h，ATG組細胞加入紫云英苷(100 μM)后進行缺氧培養(yǎng)24 h，ATG+IOX2組細胞加入紫云英苷(100 μM)和IOX2(50 μM)后進行缺氧培養(yǎng)24 h。

1.2 細胞增殖活力檢測

細胞增殖活力檢測實驗分為兩部分。第一部分：OVCAR-8和SK-OV-3細胞分別分為三組，空白對照組、ATG組和ATG+IOX2組，檢測各組細胞增殖活力；第二部分：分別以含梯度濃度的ATG聯(lián)合梯度濃度的卡鉑或順鉑的培養(yǎng)基于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)OVCAR-8和SK-OV-3細胞72 h后檢測細胞增殖活力，并使用Combenefit v2.021軟件進行聯(lián)合效應分析(LOEWE分析)。細胞均接種于96孔板中培養(yǎng)，每組做5個復孔計算平均值，細胞增殖活力檢測采用CCK-8試劑盒進行，具體步驟按照說明書所示，采用酶標儀在450 nm波長檢測各孔的吸光度(A)值以空白對照組為100%計算：細胞活力(%)=(實驗組平均A值-無細胞孔A值)/(空白對照組平均A值-無細胞孔A值)×100%。

1.3 細胞缺氧檢測

根據(jù)試劑盒說明書，使用缺氧檢測試劑盒(ENZ-51042-0125)測量缺氧細胞中的硝基還原酶活性。該試劑盒所使用的缺氧檢測試劑(探針)是一種含有硝基部分的非熒光芳香化合物，可以通過缺氧細胞中存在的硝基還原酶轉(zhuǎn)化為羥胺(NHOH)和氨基(NH2)，隨后釋放可激發(fā)紅色熒光的探針物質(zhì)。分別檢測空白對照組及ATG組OVCAR-8和SK-OV-3細胞缺氧狀態(tài)，并以正常條件培養(yǎng)的未加藥物處理的細胞為陰性對照組(Negative control group)。缺氧培養(yǎng)后用PBS洗滌細胞兩次，并加入500 μL缺氧檢測混合物(5 μL缺氧檢測試劑溶于10 mL培養(yǎng)基中)孵育30 min。吸去缺氧檢測混合物，用PBS洗滌細胞兩次。使用標準激發(fā)/發(fā)射濾光器組(Ex/Em：596/630 nm)通過熒光顯微鏡(Olympus Corporation)拍片并使用Image Pro Plus軟件進行相對熒光強度(RIF)分析。

1.4 Western blot

采用Western blot檢測空白對照組、ATG組及ATG+IOX2組細胞HIF-1α、PHD2、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達情況。收集各組細胞，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，并使用BCA法測定各組細胞蛋白樣品濃度。以每孔30 μg總蛋白量通過10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜；隨后使用3%脫脂奶粉室溫封閉1 h后一抗4℃孵育過夜；于3次TBST洗膜(5 min/次)后加入熒光二抗室溫孵育1 h后洗膜，采用Odyssey雙色紅外激光成像儀收集熒光信號。以GAPDH為內(nèi)參照，通過Quantity One-v4.6.2軟件進行蛋白表達相對定量分析。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

細胞處理與Western blot實驗一致，收集空白對照組、ATG組及ATG+IOX2組細胞，采用RNAiso Plus提取細胞RNA，并使用微量分光光度計檢測RNA濃度及純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μg總RNA去除使用gDNA Eraser去除基因組DNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qRT-PCR試劑盒，以20 μL反應體系，采用兩步法進行PCR反應(第一步：95℃ 30 s；第二步：95℃ 5 s+60℃ 34 s，40個循環(huán)；第三步：95℃ 15 s+60℃ 1 min+95℃ 15 s)，以GAPDH作為內(nèi)參。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，檢測指標及引物序列見表1。結果分析采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列表

1.6 細胞侵襲實驗

OVCAR-8和SK-OV-3細胞分為空白對照組、ATG組及ATG+IOX2組三組。細胞接種于Transwell小室，上室中分別加入無血清培養(yǎng)基及其配置的含ATG(100 μM)、含ATG(100 μM)和IOX2(50 μM)的培養(yǎng)基，下室內(nèi)加入用完全培養(yǎng)基及其配置的含ATG(100 μM)、含ATG(100 μM)和IOX2(50 μM)的培養(yǎng)基。缺氧條件培養(yǎng)24 h后，吸凈下室液體，用甲醇原液固定20 min，結晶紫染色，光學顯微鏡(200×)拍照，并隨機選取5個視野進行細胞計數(shù)，算出每個視野的平均值以對細胞侵襲能力進行相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，多重比較采用Tukey法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫云英苷對缺氧誘導的HIF-1α及其下游細胞增殖和侵襲相關因子表達的影響

采用Western blot和qRT-PCR檢測缺氧條件下ATG對卵巢癌細胞HIF-1α及其下游細胞增殖和侵襲相關蛋白表達情況。結果顯示，缺氧條件下，與空白對照組相比，ATG組OVCAR-8和SK-OV-3細胞HIF-1α蛋白表達明顯降低(P<0.001)(圖1A-B)，且促增殖相關因子PCNA以及促侵襲相關因子MMP-2和MMP-9蛋白水平均明顯降低(圖1A，C-E)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；此外，缺氧條件下，與空白對照組相比，ATG組OVCAR-8和SK-OV-3細胞HIF-1α的mRNA水平均無明顯變化(P>0.05)，但促增殖相關因子PCNA以及促侵襲相關因子MMP-2和MMP-9的mRNA表達均明顯降低(圖1F-I)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。以上結果表明，ATG可明顯抑制缺氧誘導的卵巢癌細胞HIF-1α及其下游細胞增殖和侵襲相關蛋白表達，其作用可能與HIF-1α蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)相關，而與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)無關。

2.2 紫云英苷抑制缺氧誘導的HIF-1α蛋白表達的機制

為闡明ATG降低卵巢癌細胞HIF-1α蛋白水平的機制，本研究檢測了ATG對卵巢癌細胞缺氧狀態(tài)的影響，陰性對照組紅色熒光較弱，而在缺氧培養(yǎng)條件下，空白對照組OVACR-8和SK-OV-3細胞紅色熒光較強，明顯呈現(xiàn)缺氧狀態(tài)。與空白對照組相比，ATG組細胞仍處于缺氧狀態(tài)，相對熒光強度均無明顯變化(P>0.05)(圖2A-B)。因此本研究進一步檢測了ATG對PHD2蛋白及mRNA表達水平的影響，在缺氧培養(yǎng)狀態(tài)下，與空白對照組相比，ATG組OVCAR-8和SK-OV-3細胞PHD2蛋白及mRNA表達均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖2C-E)。表明ATG可能通過上調(diào)PHD2表達促進HIF-1α降解。

圖1 紫云英苷對卵巢細胞HIF-1α及其下游細胞增殖和侵襲相關調(diào)節(jié)因子表達的影響Figure 1 Effects of astragaline on the expression of HIF-1α and its downstream factors related to proliferation and invasion in ovarian cancer cellsNotes：A-E.The expression of HIF-1α，PCNA，MMP-2 and MMP-9 protein in OVCAR-8 and SK-OV-3 cells；F-I.The expression of HIF-1α，PCNA，MMP-2 and MMP-9 mRNA in OVCAR-8 and SK-OV-3 cells.HPA：Hypoxia；ATG：Astragaline；No-treatment control(control group)：HPA+ATG-；ATG group：HPA+ATG+.NS P>0.05，***P<0.001，when compared with the control group.

2.3 PHD2抑制劑明顯減弱紫云英苷對卵巢癌細胞增殖及侵襲的抑制作用

為進一步證實ATG通過上調(diào)PHD2促進HIF-1α降解，本研究檢測了PHD2特異性抑制劑IOX2預處理對ATG抗卵巢癌細胞增殖和侵襲作用的影響，缺氧培養(yǎng)條件下，與ATG組相比，ATG+IOX2組OVCAR-8和SK-OV-3細胞HIF-1α、促增殖因子PCNA及促侵襲因子MMP-2和MMP-9的蛋白表達均明顯升高(P<0.001)(圖3A-E)；qRT-PCR結果顯示，與ATG組相比，ATG+IOX2組OVCAR-8和SK-OV-3細胞HIF-1α的mRNA表達均無明顯變化(P>0.05)(圖3F)，但PCNA、MMP-2和MMP-9的mRNA表達均明顯升高(P<0.001)(圖3G-I)。此外，在缺氧培養(yǎng)條件下，與空白對照組相比，ATG組OVCAR-8和SK-OV-3細胞增殖及侵襲均能力明顯降低(P<0.001)；而與ATG組相比ATG+IOX2組OVCAR-8和SK-OV-3細胞增殖及侵襲均能力均明顯升高(P<0.001)(圖4)。

圖2 紫云英苷對卵巢癌細胞缺氧狀態(tài)及PHD2表達的影響Figure 2 Effects of Astragaline on hypoxic status and expression levels of PHD2 in ovarian cancer cellsNote：A-B.Effect of ATG on hypoxic status of OVCAR-8 and SK-OV-3 cells；C-E.Effect of ATG on the expression of PHD2 at levels of protein and mRNA in OVCAR-8 and SK-OV-3 cells.HPA：Hypoxia.ATG：Astragaline.Negative control group：cells cultured in normal oxygen conditions；No-treatment control(control group)：HPA+ATG-；ATG group：HPA+ATG+.NS P>0.05，***P<0.001，when compared with the control group.

圖4 PHD2抑制劑明顯減弱紫云英苷對缺氧誘導的卵巢癌細胞增殖和侵襲的抑制作用Figure 4 Effect of PHD2 inhibitor on the suppressive role of Astragaline in proliferation and invasion of ovarian cancer cellsNote：A-B.Effect of IOX2 on proliferation of OVACR-8 and SK-OV-3 cells treated with ATG；C-D.Effect of IOX2 on invasion of OVACR-8 and SK-OV-3 cells treated with ATG.IOX2：PHD2 inhibitor.HPA：Hypoxia.ATG：Astragaline.No-treatment control(control group)：HPA+ATG-IOX2-；ATG group：HPA+ATG+IOX2-；ATG+IOX2 group：HPA+ATG+IOX2+.***P<0.001，when compared with the ATG group.

圖3 PHD2抑制劑明顯減弱紫云英苷對缺氧誘導的卵巢癌細胞HIF-1α及其下游細胞增殖和侵襲相關因子表達的抑制作用Figure 3 PHD2 inhibitor reduced the inhibitory effect of Astragaline on the expression suppression levels of HIF-1α and downstream proliferation-and invasion-related factors in ovarian cancer cellsNote：A-E.IOX2 reduced the inhibitory effect of astragaline on the expression of HIF-1α and its downstream factors related to proliferation and invasion in OVACR-8 and SK-OV-3 cells.F-I.IOX2 reduced the inhibitory effect of astragaline on the mRNA expression suppression levels of HIF-1α and downstream factors related to proliferation and invasion in OVACR-8 and SK-OV-3 cells.IOX2：PHD2 inhibitor.HPA：Hypoxia.ATG：Astragaline.ATG group：HPA+ATG+IOX2-；ATG+IOX2 group：HPA+ATG+IOX2+.NS P>0.05，***P<0.001，when compared with the ATG group.

2.4 紫云英苷增加卵巢癌細胞對卡鉑和順鉑的敏感性

HIF-1α及下游促增殖和侵襲相關信號通路上調(diào)是化療耐藥的重要機制之一，為進一步證實ATG的抗卵巢癌作用，本研究檢測了ATG與卡鉑和順鉑抗卵巢癌的聯(lián)合效應，LOEWE分析結果顯示為藍色表示兩種藥物具有較好的聯(lián)合作用，顯示為紅色則表示兩種藥物具有拮抗作用。本研究結果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，ATG與卡鉑以及ATG與順鉑均在OVCAR-8和SK-OV-3細胞中顯示出較好的聯(lián)合作用。表明ATG增加卵巢癌細胞對卡鉑和順鉑的敏感性(圖5)。

圖5 紫云英苷促進卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性Figure 5 Astragaline sensitized ovarian cancer cells to chemotherapeutic agentsNote：A.Synergic analysis of ATG and carboplatin in OVACR-8 cells；B.Synergic analysis of ATG and cisplatin in OVACR-8 cells；C.Synergic analysis of ATG and carboplatin in SK-OV-3 cells；D.Synergic analysis of ATG and cisplatin in SK-OV-3 cells.Cells were treated with increasing concentration of ATG and carboplatin or cisplatin in normoxic condition for 72 h，then cell proliferative capacity was measured by CCK-8 kit.Synergic analysis was performed with Combenefit v2.021 software using LOEWE analysis.

3 討論

前期研究證實[3]，ATG可通過抑制HIF-1α及其誘導的糖酵解途徑抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，并促進其凋亡，表明ATG是一種潛在的針對Warburg效應的有效抗卵巢癌藥物。為進一步闡明ATG抗卵巢癌作用的機制，本研究在缺氧培養(yǎng)條件下給予OVCAR-8和SK-OV-3細胞ATG處理，并結合PHD2抑制劑干預，證實ATG可能通過上調(diào)PHD2表達，促進缺氧誘導的HIF-1α降解，進而抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲。

缺氧誘導的HIF-1α信號通路上調(diào)是腫瘤耐藥的重要因素，HIF-1α上調(diào)可通過促進一系列促腫瘤細胞生存、增殖、侵襲、免疫逃逸等惡性行為的信號通路，進而增強腫瘤細胞對放、化療治療的耐受性[4]。因此，以HIF-1α為靶點的小分子化合物是具有較好前景的新型抗腫瘤藥物，近年來針對缺氧和HIF-1α的特異性藥物也成為腫瘤新藥發(fā)掘的熱點[5]。目前尚沒有針對HIF-1α有效的臨床抗腫瘤藥物，大多都尚處于臨床前的細胞或動物研究階段。我們的前期研究表明[3]，一種廣泛存在于食品成分中的天然黃酮類物質(zhì)—紫云英苷，在2D和3D細胞培養(yǎng)水平均顯示出較好的抗卵巢癌作用，且均呈現(xiàn)較好的時間和劑量依賴效應關系。此外，紫云英苷可明顯抑制OVCAR-8細胞遷移能力，激活線粒體凋亡途徑、增加細胞凋亡水平，且在2D及3D培養(yǎng)條件下均可抑制Glut1、Glut3、HK2、PDK1和PDK3等糖酵解途徑效果蛋白表達。表明紫云英苷在正常氧含量及缺氧環(huán)境下對卵巢癌OVCAR-8細胞增殖具有抑制作用，且其機制可能是通過抑制HIF-1α誘導的糖酵解通路以及激活線粒體凋亡通路。為進一步闡明紫云英苷抑制HIF-1α的作用機制，本研究通過缺氧培養(yǎng)激活卵巢癌細胞HIF-1α及下游促增殖和侵襲相關信號通路，并給予紫云英苷處理，結果顯示，紫云英苷可明顯抑制缺氧誘導的HIF-1α蛋白表達，進而抑制促增殖相關因子PCNA及促侵襲相關因子MMP-2和MMP-9表達，但HIF-1α的mRNA表達無明顯變化。由此可知，紫云英苷對HIF-1α的抑制作用并非抑制其轉(zhuǎn)錄水平，而是轉(zhuǎn)錄后的抑制。

HIF-1α與HIF-1β共同組合形成具有調(diào)節(jié)活性的HIF-1異源二聚體轉(zhuǎn)位進入細胞核，與含有缺氧應答原件(Hypoxia responsive elements，HREs)的啟動子結合，促進相應基因的轉(zhuǎn)錄，進而激活一系列信號通路[4]。其中，HIF-1β亞基又稱芳香烴受體核轉(zhuǎn)運子，在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，起結構性作用；而HIF-1α受缺氧信號的調(diào)控，是HIF-1的活性亞基[6]。正常氧含量條件下，合成的HIF-1α蛋白很快即被細胞內(nèi)的泛素蛋白酶—脯氨酸羥化酶(prolyl-4-hydroxylases，PHDs)所降解，其中，PHD2是主要的亞型之一。為進一步揭示紫云英苷對HIF-1α轉(zhuǎn)錄后抑制的分子機制，本研究檢測了紫云英苷處理后PHD2的表達變化，結果顯示，缺氧培養(yǎng)條件下，無處理對照組細胞PHD2的表達水平較低，而給予紫云英苷處理后，PHD2的蛋白及mRNA表達水平均明顯升高，提示紫云英苷可能通過上調(diào)PHD2表達進而實現(xiàn)對HIF-1α的轉(zhuǎn)錄后抑制。為進一步證實這一猜想，本研究在給予卵巢癌細胞紫云英苷處理的同時增加PHD2特異性抑制劑IOX2干預，結果顯示，IOX2處理可明顯減弱紫云英苷對卵巢癌細胞增殖及侵襲的抑制作用，并使紫云英苷處理后促增殖相關因子PCNA及促侵襲相關因子MMP-2和MMP-9表達升高。同時，HIF-1α蛋白水平也較單純紫云英苷處理組細胞明顯升高，而mRNA水平則無明顯差異，表明紫云英苷是通過上調(diào)PHD2表達，促進HIF-1α的降解，進而抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲。在肺癌的研究中，表明紫云英苷可抑制肺癌和肝癌細胞ERK、Akt及NF-κB等信號通路及糖酵解相關因子[7-8]，這些作用可能均通過上調(diào)PHD2表達促進HIF-1α的降解進而抑制Warburg效應實現(xiàn)。此外，HIF-1α通路被證實是腫瘤化療耐藥的重要因素，以HIF-1α為靶點的藥物均可增加卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性[9-11]，因此本研究還進一步檢測了紫云英苷與卵巢癌常用化療藥物的聯(lián)合效應，結果顯示，紫云英苷可明顯增加卵巢癌細胞對卡鉑和順鉑的敏感性，顯示出較好的聯(lián)合效應。

綜上所述，本研究結果證實紫云英苷可通過上調(diào)PHD2表達促進HIF-1α的降解，抑制Warburg效應，實現(xiàn)對卵巢癌細胞糖酵解途徑、增殖及侵襲的抑制作用，是一種潛在的抗卵巢癌化療耐藥的新型小分子天然化合物，為卵巢癌藥物治療提供了新的思路和參考。