周瑤瑤 陳鳳云 屠文駱

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡的第2位，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，早期宮頸癌首選手術(shù)治療，療效較好，但中晚期宮頸癌以放化療為主，部分患者預(yù)后不良[1]，如何提高中晚期宮頸癌患者以及復(fù)發(fā)宮頸癌患者的療效是目前婦科腫瘤領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)對(duì)宮頸癌的研究不斷深入，但宮頸癌的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。因此，目前迫切需要進(jìn)一步深入探討宮頸癌的具體發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌尤其是中晚期及復(fù)發(fā)性宮頸癌的治療與預(yù)后提供新思路。棕櫚酸(Palmitateacid，PA)是16碳長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸，分子式為C16H32O2。它是棕櫚油中飽和脂肪酸的主要成分[2]，占其總脂肪酸含量的44%～52%[3]。它的生物學(xué)和藥理學(xué)活性廣泛，研究顯示其與代謝綜合征、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥等具有相關(guān)性[4-5]。最近的研究報(bào)道其有抗腫瘤作用[6]，主要應(yīng)用于乳腺癌和結(jié)腸癌[7]，但其抗宮頸癌的作用鮮有報(bào)道。此外，真核生物體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)衰老、變性需依賴(lài)細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量，而PA的具體抗腫瘤作用是否與其誘導(dǎo)凋亡相關(guān)尚未闡明。本研究在體外采用不同濃度PA處理人宮頸癌HeLa細(xì)胞，檢測(cè)PA對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，探討PA對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞部分作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人類(lèi)宮頸癌細(xì)胞HeLa系購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；PA購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；CCK-8購(gòu)于日本同仁公司；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)康寧公司；熒光倒置生物顯微鏡購(gòu)于德國(guó)萊卡公司；Bio-Rad550酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、處理及分組 HeLa細(xì)胞使用含10% FBS的高糖DMEM完全培養(yǎng)基(完培)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用PBS清洗2次，加入0.025%胰酶(含0.02% EDTA)消化。等細(xì)胞全部脫壁漂浮后，加入3倍體積的完全培養(yǎng)基中和胰酶，1 000 rpm離心5 min，棄去上清，用完全培養(yǎng)基重懸HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液待用。PA溶于DMSO中，配成100 mg/mL母液保存于4℃冰箱。所有濃度的PA均由母液稀釋于高糖DMEM培養(yǎng)基中。HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組(不加藥)、PA處理組(分別加入PA 25、50、100 μg/mL處理48 h)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PA毒性 取細(xì)胞懸液按100 μL/孔接種于96孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，將HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組、PA處理組。隨后向每孔加10 μL CCK-8溶液，移入培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光孵育1 h，取出培養(yǎng)板，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定每孔的吸光光度(OD)值，并繪制細(xì)胞增殖曲線。每個(gè)樣品每次含有3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Transwell遷移侵襲試驗(yàn) 將涂有50 μL基質(zhì)膠(基質(zhì)膠/無(wú)血清培養(yǎng)基：1/5)的Transwell小室，其孔徑為8 μm，放在一個(gè)24孔板上。將HeLa細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/mL)用100 μL含有不同濃度PA(25、50、100 μg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，置于小室的上部。將600 μL完培加入小室的下部。將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，用濕棉簽刮擦每個(gè)Transwell室膜的上部以除去未發(fā)生遷移及侵襲的細(xì)胞。遷移及侵襲的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色。從6個(gè)隨機(jī)選擇的顯微鏡視野計(jì)數(shù)平均遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)mRNA的表達(dá) 取細(xì)胞懸液按1 000 μL/孔接種于12孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，將HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組、PA處理組。隨后用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒分別提取各組細(xì)胞的總RNA。以紫外分光光度計(jì)A280、A260定量測(cè)定，使提取總RNA測(cè)量結(jié)果純度A280/A260為1.8～2.0，濃度≤500 ng/μL為合格。質(zhì)量合格的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，熔解曲線分析：溫度60～95℃。采用2-ΔΔCT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析，每個(gè)樣品每次含有2個(gè)復(fù)孔，結(jié)果來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR所用的引物序列

1.2.5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取細(xì)胞懸液按2000 μL/孔接種于6孔板中培養(yǎng)。將HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組、PA處理組。隨后用冷的PBS洗滌，并以2 000 rpm離心10 min以重懸于Binding buffer中。然后加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC，在黑暗中孵育15 min。在流式分析之前將5 μL碘化丙啶加入管中。最后，使用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，并通過(guò)Flowjo軟件進(jìn)行分析。每個(gè)樣品每次含有3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析隨后用Tukey分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PA對(duì)HeLa細(xì)胞活性的影響

將對(duì)照組的細(xì)胞活性設(shè)為1，與對(duì)照組比較，25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mLPA組Hela細(xì)胞的存活率逐漸降低，分別為(0.806±0.056)、(0.582±0.025)、(0.304±0.085)。不同濃度PA組之間Hela細(xì)胞的存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.0，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0084；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0035；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P=0.0009)(圖1)，Hela細(xì)胞的存活率隨著PA濃度的增加而下降，提示PA對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用具有藥物劑量依賴(lài)性。

圖1 CCK-8方法檢測(cè)PA對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Cell viability of Hela cells treated with PANote：* P<0.05，when compared with PA at different concentrations.

2.2 PA對(duì)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

用基質(zhì)膠包被的小室進(jìn)行遷移和侵襲試驗(yàn)，以研究PA對(duì)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，25 μg/mL PA處理的HeLa細(xì)胞其遷移和侵襲能力顯著減弱(F=141.3，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001)(圖2A和2B)，且50 μg/mL PA的抑制效果優(yōu)于25 μg/mL(P=0.0171)，100 μg/mL PA的抑制效果優(yōu)于50 μg/mL(P=0.0031)，表明PA抑制Hela細(xì)胞的遷移和侵襲能力具有藥物濃度依賴(lài)性。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)觀測(cè)各組Hela細(xì)胞遷移、侵襲情況Figure 2 The abilities of migration and invasion of Hela cells treated with PANote：A.Migration and invasion of Hela cells after PA treatment；B.The results of statistical analysis(*P<0.05).

2.3 PA對(duì)Hela細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)對(duì)照組和PA處理組的Hela細(xì)胞進(jìn)行凋亡相關(guān)基因的檢測(cè)，可見(jiàn)凋亡保護(hù)基因Bcl-2在不同濃度的PA作用下均降低，且不同濃度PA組之間的Bcl-2表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=164.5，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0017；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0029；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)(圖3A)；凋亡促進(jìn)基因Bax在不同濃度的PA作用下均升高(F=121.5，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0100；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0066；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)，且Cleaved-caspase-3在不同濃度PA組之間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=425.1，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P<0.0001；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)(圖3B和3C)。表明Hela細(xì)胞的凋亡水平隨著PA濃度的增加而上升，提示PA對(duì)Hela細(xì)胞的促凋亡作用具有藥物劑量依賴(lài)性。

圖3 qRT-PCR方法檢測(cè)HeLa細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)Figure 3 The expression of apoptosis-related gene in Hela cells treated with PANote：A.The expression of bcl-2 gene in PA groups(*P<0.05)；B.The expression of bax gene in PA groups(*P<0.05)；C.The expression of cleaved-caspase-3 gene in PA groups(*P<0.05).

2.4 PA對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步對(duì)PA誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡進(jìn)行量化，用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色細(xì)胞，隨后用流式細(xì)胞術(shù)分析。PA處理組凋亡細(xì)胞的數(shù)量以劑量依賴(lài)性方式增加(F=262.6，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P<0.0001；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P=0.0064)(圖4A)。凋亡細(xì)胞的比例從0.280±0.027(25 μg/mL)增加到0.593±0.043(100 μg/mL)，而未經(jīng)治療的對(duì)照組僅為0.010±0.007(圖4B)。表明PA可以明顯增加Hela細(xì)胞的凋亡率，且隨著PA濃度的增加而上升。

圖4 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡情況Figure 4 PA induced apoptosis in Hela cellsNote：A.The distribution of Hela cells treated with PA by flow cytometry；B.The results of statistical analysis(*P<0.05).

3 討論

婦科惡性腫瘤宮頸癌發(fā)病率高、惡性程度大，我國(guó)每年約有2萬(wàn)余名婦女死于宮頸癌[8]。為改善宮頸癌患者預(yù)后，降低放療、化療副反應(yīng)和復(fù)發(fā)率，科研人員不斷的探索研究。PA是16碳長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸，是棕櫚油中飽和脂肪酸的主要成分[2]，占其總脂肪酸含量的44%～52%[3]，分子式為C16H32O2。它的生物學(xué)和藥理學(xué)活性廣泛，研究顯示其與代謝綜合征、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥和腫瘤相關(guān)。本研究通過(guò)人宮頸癌HeLa細(xì)胞為對(duì)象，觀察PA對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力和凋亡的影響。CCK-8結(jié)果表明，不同劑量PA(25、50和100 μg/mL)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖有抑制作用，且該抑制作用呈劑量依賴(lài)性。遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著PA濃度的增加，HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力隨之減弱。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因調(diào)控下，為適應(yīng)外界環(huán)境的影響主動(dòng)程序死亡的過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞變形且體積縮小，貼壁培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)變圓、皺縮、脫落，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊聚，分割成塊狀和凋亡小體等[9]。大量的研究表明，藥物治療宮頸癌疾病主要是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡[10]，其中線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡最主要的途徑之一，通常凋亡信號(hào)能引起線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔(PT)開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降[11]。隨著線粒體膜功能障礙，細(xì)胞會(huì)募集并激活Caspase-3，進(jìn)而誘發(fā)Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。氧化應(yīng)激、輻射和抗癌劑可誘導(dǎo)內(nèi)源性信號(hào)通路的激活，從而導(dǎo)致Bcl家族表達(dá)并干擾線粒體膜電位[13]。在線粒體外膜中，Bcl-2家族蛋白的平衡被認(rèn)為能夠維持線粒體膜電位和線粒體功能[14]。因此，Bcl家族是內(nèi)在信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵指標(biāo)，高Bcl2表達(dá)可以避免細(xì)胞凋亡。然而，Bax可以幫助內(nèi)在途徑的進(jìn)展。如本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PRC結(jié)果所示，在用PA處理后，會(huì)顯著增加細(xì)胞質(zhì)促凋亡Bax和Cleaved-caspase-3基因表達(dá)而降低抗凋亡Bcl-2基因水平，破壞線粒體膜電位，進(jìn)而促進(jìn)線粒體驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞凋亡，表明PA通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體凋亡Bcl-2蛋白家族，發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。另外流式細(xì)胞結(jié)果顯示，隨著PA濃度的提高，HeLa細(xì)胞的凋亡水平顯著上升。因此，PA可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)在信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡并引起線粒體功能障礙。本研究初步驗(yàn)證了PA對(duì)HeLa細(xì)胞增殖，遷移、侵襲和凋亡的影響，詳細(xì)的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。