來森艷 胡發(fā)涌 吳 維 李國東 李小蘭 曹小年

DAB2IP(又名ASK1-interacting protein-1，AIP1)是RasGTPase活化蛋白家族的重要成員之一，其能夠與細胞凋亡信號調節(jié)激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)結合，調控TNFα誘導的細胞凋亡[1]。DAB2IP能夠抑制H-Ras、R-Ras以及TC21的活性從而抑制表皮生長因子誘導的前列腺癌細胞的增殖[2]。此外，DAB2IP能夠通過調控PI3K/Akt信號通路，抑制前列腺癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡[3-4]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制DAB2IP能夠通過誘導前列腺癌細胞上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，促進其侵襲和遷移[5]。研究表明，DAB2IP在雄激素依賴和非依賴的前列腺癌患者中均存在缺失，其在腫瘤中的缺失主要是其啟動子受表觀遺傳學調控所致。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，DAB2IP在許多實體瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[6]，但是，目前關于DAB2IP在結直腸癌細胞中的功能卻少有研究，為此，本研究利用實驗室前期保存的DAB2IP高表達質粒，篩選了DAB2IP高表達的穩(wěn)定細胞系，探討DAB2IP對結直腸癌細胞侵襲及遷移能力的影響，并初步探索其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

結直腸癌HT29細胞由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院分子醫(yī)學中心實驗室保存[15]，培養(yǎng)于37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基以及0.25%胰蛋白酶均購自美國Hyclon公司；GAPDH、DAB2IP、E-cadherin和vimentin一抗均購自CST公司(稀釋濃度為1∶1 000)；二抗均購自北京康為生物公司(稀釋濃度為1∶5 000)；轉染試劑Lipofectamine2000購自上海英駿公司；OPTI-MEN購自美國Gibico公司；Western blot制膠試劑盒購自武漢谷歌生物公司；PVDF膜購自美國Millipore公司，Transwell小室購自碧云天生物公司。

1.2 DAB2IP高表達穩(wěn)定細胞系篩選

將攜帶DAB2IP編碼序列的pCDNA3.1質粒和空的pCDNA3.1質粒(由本實驗室前期保存)通過Lipofectamin2000轉染HT29細胞24 h后，向細胞中加入適量的G418進行篩選(10 μg/mL)，并以沒有轉染的HT29細胞為參照，維持篩選2周后通過Western blot和Real-time PCR進行驗證。

1.3 Transwell實驗

將穩(wěn)定高表達DAB2IP和陰性對照的HT29細胞種植于Transwell小室無血清上層(104/孔)，下層為含10%血清的培養(yǎng)基，12 h后，洗去上層細胞，并以結晶紫染色下層細胞，最后于顯微鏡下觀察，并取高倍視野下染色細胞計數(shù)，進行統(tǒng)計學分析。

1.4 細胞劃痕實驗

將穩(wěn)定高表達DAB2IP和對應的陰性對照的HT29細胞種植于6孔板中，待細胞生長至95%以上融合度時，更換無血清培養(yǎng)基，以2 μm無菌移液器槍頭于細胞中行劃痕，并測量其寬度，12 h后，再次于顯微鏡下測量其寬度，兩次差值為細胞遷移距離，重復實驗三次，并分析統(tǒng)計學差異。

1.5 Western blot實驗

正常培養(yǎng)穩(wěn)定高表達DAB2IP的HT29細胞和陰性對照細胞，待細胞狀態(tài)良好時收集細胞，以NP40裂解細胞并提取細胞總蛋白，檢測蛋白濃度，并計算各組蛋白上樣量(50 μg/孔)，經SDS高溫變性后上樣，10%的SDS-PAGE凝膠電泳至合適時間，轉膜(PVDF膜，350 mA，恒流轉膜90 min)，4℃恒溫孵育相應一抗過夜，洗滌(3次，15 min/次)，孵育相應的二抗(37℃，2 h)，最后于電子化學顯色儀顯色。檢測各組蛋白中E-cadherin和vimentin蛋白的表達，并以GAPDH為參照調整上樣量。

1.6 Real-time PCR方法

培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，收集細胞，通過Trizol裂解法提取細胞RNA，并測量RNA濃度，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，根據(jù)特異性引物行Real-time PCR擴增，DAB2IP上游：5′-CTTGACCATGAACGCG CAGT-3，下游：5′-ATACTCTCTTTCAGCTGGGTCAGG-3；GAPDH上游：5′-GGAATTGACGGAAGGGCACCACC-3′，下游：5′-GTGCAGCCCCGGACATCT AAGG-3′，PCR擴增條件如下：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火，68℃延伸，循環(huán)數(shù)為40。結果分析采用2-ΔΔct法計算，公式如下：DAB2IP基因相對表達量=2-^{(實驗組DAB2IP基因CT值-GAPDH基因CT值)-(對照組DAB2IP基因CT值-對照組GAPDH基因CT值)}。

1.7 統(tǒng)計分析方法

2 結果

2.1 DAB2IP高表達的HT29穩(wěn)定細胞系的構建及鑒定

HT29細胞轉染DAB2IP高表達質粒及對應的空載體后，加入10 μg/mL的G418篩選細胞。待細胞生長良好時收集細胞，提取細胞mRNA和總蛋白，通過Real-time PCR和Western blot方法檢測各組細胞中DAB2IP的表達。結果發(fā)現(xiàn)，高表達DAB2IP組的細胞與陰性對照相比，其DAB2IP的mRNA水平為對照組的(12.45±1.35)倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，Western blot結果表明，DAB2IP蛋白水平亦明顯升高，表明DAB2IP穩(wěn)定細胞系篩選成功(圖1)。

2.2 DAB2IP對HT29細胞侵襲及遷移能力的影響

通過Transwell實驗，計數(shù)穿過小室的細胞數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)高表達DAB2IP組12 h后遷移細胞數(shù)及侵襲細胞數(shù)分別為268.2±15.4個及182.6±12.4個，對應的陰性對照組遷移及侵襲細胞數(shù)分別為106.4±5.6個及63.8±4.2個，兩組差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。進一步，我們通過細胞劃痕實驗檢測DAB2IP對HT29細胞遷移能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，對照組細胞12 h遷移距離為205.6±6.8 μm，而高表達DAB2IP組細胞12 h遷移距離為98.6±3.4 μm，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。以上結果表明，高表達DAB2IP能夠明顯抑制HT29細胞的侵襲及遷移能力(圖2)。

圖1 DAB2IP高表達穩(wěn)定細胞系的構建Figure 1 Construction of stable cell line with high expression of DAB2IP in HT29 cellsNote：A.The mRNA level of DAB2IP was determined in high expression of DAB2IP and control HT29 cells by Real-time PCR；B.The protein level of DAB2IP was detected in high expression of DAB2IP and control HT29 cells by Western blot.

2.3 DAB2IP對HT29細胞E-cadherin和vimentin蛋白表達的影響

將高表達DAB2IP和陰性對照細胞正常培養(yǎng)至一定密度，收集細胞并裂解細胞總蛋白，通過Western blot方法檢測各組E-cadherin和vimentin蛋白的表達，以GAPDH作為內參定量。結果發(fā)現(xiàn)高表達DAB2IP能夠明顯促進E-cadherin蛋白的表達，抑制vimentin蛋白的表達，表明高表達DAB2IP能夠抑制HT29細胞上皮間質轉化過程(圖3)。

圖3 高表達DAB2IP抑制HT29細胞EMT過程Figure 3 Over-expression of DAB2IP blocked epithelial-mesenchymal transition in HT29 cellsNote：The expression of DAB2IP，E-cadherin and vimentin protein was determined in HT29 cells with over-expressing DAB2IP or their control cells by Western blot.

圖2 高表達DAB2IP抑制HT29細胞侵襲及遷移能力Figure 2 Over-expression of DAB2IP inhibited the invasion and migration of HT29 cellsNote：A.HT29 cells and HT29-DAB2IP over-expression cells were cultured in trans-well chamber，cell migration(up left)and cell invasion(down left)ability were tested by trans-well assay after 12 hours，and the corresponding quantization table is on the right(n=3)；B.HT29 control cells and HT29-DAB2IP over-expression cells were cultured in 6-well plate，cell migration ability was measured by Wound healing assay(n=3).

3 討論

結直腸癌是威脅人類健康的最常見惡性腫瘤之一，許多基因的異常表達參與了結直腸癌的發(fā)生與發(fā)展過程，如抑癌基因APC、TP53失活突變；癌基因PI3K、KRAS、BRAF等的異?；罨痆7-9]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)DAB2IP在結直腸癌中呈低表達甚至缺失狀態(tài)，其異常低表達狀態(tài)提示患者預后差，且低表達DAB2IP能夠通過介導NFκB-p65信號通路及EMT信號通路維持細胞“干性”[10]。因此，本研究在實驗室前期工作的基礎上，初步探討過表達DAB2IP在結直腸癌細胞中的功能。

腫瘤細胞的分化程度是影響腫瘤進展及預后的重要因素。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)DAB2IP在結直腸癌患者組織中呈明顯表達，且DAB2IP的缺失或低表達與患者腫瘤的分化程度密切相關[10]。腫瘤細胞的侵襲遷移能力是影響患者預后的另一重要因素。Xie等[4]研究發(fā)現(xiàn)DAB2IP能夠通過調控GSK-3β信號通路調控前列腺癌細胞的侵襲遷移能力，但在結直腸癌細胞中，目前關于DAB2IP影響細胞侵襲遷移能力的報道甚少。多種途徑參與了腫瘤細胞侵襲及遷移能力的調控，包括基質金屬蛋白酶家族(Matrix metalloproteinase，MMPs)表達的異常EMT、腫瘤細胞分泌促血管生成因子、腫瘤癌巢微環(huán)境的改變等[11]。其中，EMT在促進腫瘤細胞侵襲遷移能力的過程中發(fā)揮著重要的作用，也是目前研究腫瘤細胞侵襲遷移能力的熱點。

為了進一步研究DAB2IP對結直腸癌細胞侵襲遷移能力的影響，我們利用前期實驗室保存的過表達DAB2IP的質粒，成功篩選出了DAB2IP穩(wěn)定高表達的HT29細胞系，并通過Real-time PCR及Western blot方法進行驗證，這為我們以后進一步研究DAB2IP在結直腸癌中的功能提供了良好的工具。在此基礎上，我們初步探索了DAB2IP對HT29細胞侵襲轉移能力的影響，結果顯示，高表達DAB2IP能夠明顯抑制HT29細胞的侵襲及遷移能力；我們進一步發(fā)現(xiàn)，高表達DAB2IP能夠明顯抑制HT29細胞的EMT過程。這表明DAB2IP可能通過經典的EMT過程調控HT29細胞的侵襲及遷移能力。但DAB2IP調控HT29細胞EMT的具體機制尚不完全明了，這是我們今后將繼續(xù)研究的方向之一；此外，過表達DAB2IP是否能夠誘導結直腸癌細胞的分化，這也將是我們進一步研究的方向。

EMT在細胞的多種生物學功能方面發(fā)揮著重要的作用，其中最主要為維持細胞的“干性”及促進腫瘤細胞侵襲轉移。其中E-cadherin和vimentin是反應細胞上皮和間質狀態(tài)的最主要表面標志物。研究表明，包括NF-κB、TGF-β及GSK-3β在內的多種信號通路參與了細胞EMT過程，其主要通過調控EMT相關轉錄因子的表達調控細胞EMT進程，后者包括TWIST1、SNAIL1/2及Zeb1/2[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)DAB2IP在不同腫瘤細胞中調控細胞EMT過程的機制不盡相同，在前列腺癌細胞中，DAB2IP可能通過調控GSK-3β介導的信號通路調控細胞的侵襲遷移能力[4]，但在結直腸癌細胞中，DAB2IP可能通過調控NF-κB介導的信號通路調控細胞EMT，從而在結直腸細胞的“干性”維持中發(fā)揮著重要的作用[10]，這表明DAB2IP調控細胞EMT進程的機制比較復雜，可能存在多種途徑，進一步深入研究DAB2IP在細胞EMT進程中的機制對發(fā)掘DAB2IP的功能具有重大的意義，可能為治療轉移性結直腸癌患者提供新的靶點和思路，改善患者預后。

綜上所述，在成功構建的DAB2IP穩(wěn)定高表達的HT29細胞中，細胞的侵襲及遷移能力受到明顯抑制，其可能通過抑制細胞EMT來實現(xiàn)，我們前期研究亦發(fā)現(xiàn)低表達DAB2IP能夠通過促進細胞上皮間質轉化過程，促進細胞的侵襲及遷移能力，提示針對DAB2IP及相關通路蛋白的研究，可能為結直腸癌的治療提供新的理論依據(jù)。