宋佳文，徐福遠(yuǎn)，蔣煊，吳國娣，蔣必穎，傅紅興

（1.麗水市人民醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

胰島移植是目前微創(chuàng)并能達(dá)到患者血糖精確控制的外科治療方法，近幾年來在同種異體和異種胰島移植領(lǐng)域都取得了長足的進(jìn)展[1-3]。分離得到大量高純度和高活性的胰島是胰島移植的首要工作，其中膠原酶在胰腺消化和胰島分離中起著重要作用。目前國內(nèi)胰島分離的膠原酶大多為國外進(jìn)口，產(chǎn)品價(jià)格高，到貨時(shí)間慢，批次間質(zhì)量很難保證一致，這對(duì)國內(nèi)胰島移植工作的開展造成了較大的影響[4]。本實(shí)驗(yàn)使用一種國產(chǎn)膠原酶，并結(jié)合中性蛋白酶，進(jìn)行了小鼠胰島分離，對(duì)分離得到的胰島進(jìn)行了數(shù)量、活性和體內(nèi)移植效果的研究，對(duì)比進(jìn)口Sigma V型膠原酶，摸索出該國產(chǎn)膠原酶在小鼠胰島分離中使用的條件和分離效果，為后續(xù)該膠原酶用于大動(dòng)物胰島分離和移植研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：正常Balb/c小鼠，10周齡左右，體重20～23 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑材料：膠原酶凍干粗品（批號(hào)：JCA160101，規(guī)格：1 288 U/mg，上海喬源生物制藥有限公司）；中性蛋白酶（批號(hào)：20180109，規(guī)格：2 726 U/mg，上海喬源生物制藥有限公司）；血糖儀（蘇州施萊醫(yī)療器械有限公司）；Ⅴ型膠原酶、二乙酸熒光素（FDA）、碘化吡啶（PI）、鏈脲佐菌素（STZ） （Sigma公司，美國）；異氟烷（Baxter公司，美國）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、CMRL 1066（溫州市怡康細(xì)胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司）；倒置熒光顯微鏡（Eclipse Ti-S，尼康映像儀器銷售（中國）有限公司）；體視顯微鏡（SDT-TL2，上海光泉光科儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠原酶溶液的配制：（1）國產(chǎn)膠原酶溶液的配制：根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照實(shí)驗(yàn)所用小鼠數(shù)量，精密稱取膠原酶凍干粗品，用Hank’s液完全溶解，且分別稀釋成濃度為1.0、1.5、2.0 mg/mL的膠原酶凍干粗品溶液。（2）含中性蛋白酶的膠原酶溶液的配制：根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Hank’s液完全溶解分別稀釋成濃度為1.0 mg/mL膠原酶+1 363 U/mL中性蛋白酶、1.0 mg/mL膠原酶+2 726 U/mL中性蛋白酶的混合膠原酶溶液。（3）對(duì)照組Sigma V型膠原酶溶液的配制：用Hank’s液溶解V型膠原酶凍干粉制成1.0 mg/mL的膠原酶液。所有溶液均采用4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠糖尿病模型的建立：造模前正常Balb/c小鼠禁食不禁水12～16 h，測定空腹血糖和稱重，腹腔快速注射STZ檸檬酸緩沖溶液（200 mg/kg），72 h后測血糖≥11.0 mmol/L為糖尿病造模成功，模型穩(wěn)定1周后選取血糖20～30 mmol/L的小鼠行腎被膜下胰島移植[5]。

1.2.3 胰島的分離純化：參考前期研究基礎(chǔ)[5-7]，簡述如下，取小鼠，頸椎脫臼處死后開腹，動(dòng)脈夾夾閉膽總管至十二指腸入口，用30 G針頭逆行膽總管插管，灌注配制好的膠原酶或含中性蛋白酶的膠原酶溶液2 mL，膨脹的胰腺在（37±0.5）℃恒溫水浴中振搖消化至乳糜和泥沙狀，加冷的Hanks液中止消化；將組織離心洗滌后，用Ficoll-1119和Ficoll 1077液進(jìn)行不連續(xù)密度梯度胰島純化。將得到的高純度胰島洗滌后用CMRL 1066（含10%胎牛血清和青鏈霉素）在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 胰島計(jì)數(shù)及當(dāng)量計(jì)算：將胰島細(xì)胞團(tuán)移至一底部帶500 μm格子的培養(yǎng)皿中，顯微鏡下對(duì)每個(gè)格中的胰島細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行計(jì)數(shù)和直徑估算，并換算為直徑相當(dāng)于150 μm的胰島量，得到胰島的數(shù)量和當(dāng)量（IEQ）[8]。

1.2.5 胰島活性檢測：以二乙酸熒光素（FDA）和碘化吡啶（PI）溶液雙染色鑒定小鼠胰島細(xì)胞團(tuán)的活性，方法如下。取培養(yǎng)6 h后的胰島細(xì)胞團(tuán)，加入PI、FDA溶液各8 μL，在倒置熒光顯微鏡下，以綠色激發(fā)光下胰島中顯紅色的細(xì)胞（死亡細(xì)胞）占整個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)的比例，估算胰島活性大小，50個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)的平均活性數(shù)據(jù)即為胰島活性。

1.2.6 糖尿病小鼠腎被膜下胰島移植：參考本實(shí)驗(yàn)室的方法[6]，簡述如下。取糖尿病Balb/c小鼠，異氟烷持續(xù)吸入麻醉后，用眼科剪小心剪開背面右腎部位腹膜，用棉簽擠壓出腎臟，再用一套有加長頭槍頭的1 mL注射器將培養(yǎng)6 h后的350～400 IEQ胰島細(xì)胞團(tuán)緩慢注入至腎被膜下。注入完畢后將腎臟放回并縫合，再用紅霉素軟膏涂抹傷口；以Sigma膠原酶V分離的胰島移植做對(duì)照。

1.2.7 胰島移植術(shù)后護(hù)理：小鼠胰島移植完成后1周內(nèi)每天皮下注射頭孢唑林鈉溶液100 μL，并每天觀察小鼠狀態(tài)，定期在上午9點(diǎn)半左右測量和記錄小鼠30日內(nèi)血糖值。非空腹血糖連續(xù)2天≥16.7 mmol/L則視作移植失效[9]。術(shù)后14 d，各取移植組小鼠一只，獲取含胰島的腎臟，用4%多聚甲醛液固定24 h后，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE染色）和胰島素免疫組化染色（Insulin免疫組化染色），觀察移植后胰島的組織學(xué)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胰島分離的結(jié)果

采用本批次國產(chǎn)膠原酶、含中性蛋白酶的國產(chǎn)膠原酶和Sigma V型膠原酶溶液作為小鼠胰腺的灌注和消化液，均可分離得到外形圓整、大小不一的小鼠胰島細(xì)胞團(tuán)，如圖1所示。各組膠原酶進(jìn)行胰島分離過程中的消化時(shí)間、獲得的胰島量，以及培養(yǎng)6 h后的胰島活性結(jié)果如表1所示。由表1可知，本批次國產(chǎn)膠原酶在小鼠胰腺消化時(shí)間上均比Sigma膠原酶V（濃度1.0 mg/mL）的長；在添加中性蛋白酶后，可使小鼠胰腺消化的時(shí)間縮短，但仍長于Sigma膠原酶V（P＜0.01）；單純國產(chǎn)膠原酶在胰島獲得量上也少于膠原酶V組（P＜0.01）；國產(chǎn)膠原酶消化的胰腺組織偶爾有少量組織消化不完全，需要二次消化；2.0 mg/mL膠原酶易使部分胰腺組織過度消化，導(dǎo)致獲得的胰島量最少；加入高濃度中性蛋白酶后，分離得到的胰島數(shù)量有所增加，與進(jìn)口膠原酶V組分離的胰島在數(shù)量和當(dāng)量上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。分離的胰島經(jīng)體外培養(yǎng)6 h后，F(xiàn)DA-PI染色顯示小鼠胰島平均活性均＞80%。

圖1 分離得到的小鼠胰島細(xì)胞團(tuán)（×100）

表1 國產(chǎn)膠原酶和Sigma膠原酶分離的小鼠胰島細(xì)胞團(tuán)的結(jié)果（n=6）

2.2 移植后小鼠的血糖變化結(jié)果

本次胰島移植采用1.0 mg/mL國產(chǎn)膠原酶+2 726 U/mL中性蛋白酶為消化液分離的小鼠胰島，和進(jìn)口膠原酶V分離的小鼠胰島進(jìn)行同系糖尿病小鼠胰島腎被膜下胰島移植。由圖2可見，國產(chǎn)膠原酶分離的小鼠胰島移植后，糖尿病小鼠的血糖可在24 h內(nèi)降至正常，48 h內(nèi)部分小鼠的血糖值有波動(dòng)。移植成功后的小鼠血糖控制穩(wěn)定，并可長時(shí)間維持血糖在正常水平（＞30 d），與進(jìn)口Sigma膠原酶分離的小鼠胰島腎被膜下移植的結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 移植后胰島的組織學(xué)檢查結(jié)果

胰島移植后第14天，取含胰島的小鼠腎組織，經(jīng)固定、包埋、切片后，進(jìn)行HE染色和胰島素免疫組化染色。由圖3結(jié)果可知，糖尿病小鼠胰島移植14 d后，Insulin免疫組化染色顯示腎被膜下較多陽性組織，說明該含中性蛋白酶的國產(chǎn)膠原酶組和Sigma膠原酶V組的胰島細(xì)胞團(tuán)在小鼠腎被膜下形態(tài)均較完整，活性良好，胰島素分泌旺盛。

圖2 胰島移植后小鼠的血糖變化結(jié)果

3 討論

圖3 腎被膜下胰島HE染色（×100）與免疫組化染色（×100）結(jié)果

膠原酶是溶組織梭菌的發(fā)酵產(chǎn)物，基于底物特異性和氨基酸分析，膠原酶的主要成分包括Col G和Col H，但兩種酶成分在胰島分離中的最佳比例仍存在一些不確定性[10-11]?，F(xiàn)已知Sigma膠原酶V的主要成分為Col H[12]，本批次的國產(chǎn)膠原酶中Col G/Col H的比例約為1.2（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此在小鼠胰腺組織消化速度上的差異原因可能為主要成分比例的差異。中性蛋白酶也可用于消化組織或器官中的細(xì)胞外基質(zhì)，作用迅速且溫和，可保護(hù)細(xì)胞膜完整[13]，本次國產(chǎn)膠原酶中添加中性蛋白酶后，小鼠胰腺消化時(shí)間明顯縮短，所得胰島量和細(xì)胞活性也有增加。

目前，動(dòng)物胰島分離領(lǐng)域主要使用的膠原酶仍是Sigma公司的膠原酶V，但膠原酶的生產(chǎn)和在胰島分離領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展迅速，如對(duì)溶組織梭菌的培養(yǎng)采用人血清白蛋白、植物蛋白，代替原有的牛血清白蛋白[14]；將膠原酶主要成分先分離、純化后再進(jìn)一步按比例混合，結(jié)合中性蛋白酶用于進(jìn)行人胰島的分離等，在胰島分離的數(shù)量和完整度上均取得了很好的結(jié)果[15]。本實(shí)驗(yàn)研究了一種國產(chǎn)膠原酶，并結(jié)合中性蛋白酶，獲得了數(shù)量較多、活性較好的小鼠胰島細(xì)胞團(tuán)，且體內(nèi)移植的降血糖結(jié)果與Sigma膠原酶V的結(jié)果無差異。本研究可為該國產(chǎn)膠原酶的質(zhì)量提升和替代進(jìn)口膠原酶用于后續(xù)大動(dòng)物胰島分離的研究提供參考。