石小康，丁佑銘，汪斌，余斌，徐雨

（武漢大學人民醫(yī)院 肝膽外科，湖北 武漢 430060）

原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）是最常見的惡性腫瘤之一，其中以肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）多見，約占70%～90%[1]。據(jù)統(tǒng)計，在癌癥死因中，肝細胞癌是僅次于肺癌和胃癌的第三大死因，全球每年新增肝癌患者約841 000例患者，死亡病例高達782 000左右[2]。值得注意的是，僅中國就占每年新增病例和死亡人數(shù)的一半以上[3]。根治性治療術是目前治療肝癌的主要手段，通過嚴格的入選標準，部分患者甚至可以達到治愈的效果。盡管如此，由于大多數(shù)肝癌患者發(fā)現(xiàn)時間晚，且術后復發(fā)率高，故其預后仍然欠佳[4]。因此，亟需深入研究肝癌的發(fā)病機制，尋找敏感性高、特異性強的腫瘤標志物，以期為肝癌的早期診斷、有效治療及預后判斷提供可靠依據(jù)。細胞周期是生命活動的重要生物過程，腫瘤的形成與正常細胞周期失調息息相關。細胞周期蛋白B1（CyclinB1，CCNB1）為G2/M期的起重要調控作用的細胞周期蛋白，是啟動有絲分裂的關鍵分子。諸多研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織中表達上調，如非小細胞肺癌[5]、乳腺癌[6]、胃癌[7]、結直腸癌[8]等。亦有研究發(fā)現(xiàn)該基因在肝癌組織呈高表達，且其表達水平與肝癌患者不良預后關系密切[9]。CCNB1是否可作為腫瘤治療的新靶點，引起國內外學者的關注。本文基于癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)庫肝癌組織標本數(shù)據(jù)，利用生物信息學分析CCNB1在肝癌中的表達并探究其異常表達的潛在機制；同時還分析了其異常表達在肝癌患者中的臨床意義，旨在闡明其在肝癌早期診斷及預后評估等方面的價值。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與數(shù)據(jù)篩選

截至目前，TCGA數(shù)據(jù)庫收錄了來源于11 000多個腫瘤樣本的33種類型的癌癥數(shù)據(jù)資料?；诖耍狙芯繌腡CGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載肝癌及正常肝組織樣本的mRNA seqV2表達譜數(shù)據(jù)集及匹配的患者臨床病理資料。納入標準：（1）病理確診為肝細胞肝癌的肝癌患者；（2）有完整的臨床資料及預后隨訪資料；獲取的CCNB1基因表達譜數(shù)據(jù)經(jīng)Log2處理后用于后續(xù)分析。經(jīng)嚴格的納入標準篩選，最終余下正常肝組織樣本50例，肝癌組織樣本365例，其中有314例包含完整的無病生存時間隨訪。同時，從The Human Protein Atlas（HPA）數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）[10]下載CCNB1蛋白在肝癌組織（n=12）及正常組織（n=3）中的表達數(shù)據(jù)，旨在研究CCNB1在腫瘤組織及正常組織中蛋白水平的表達差異；此外，從UCSC xena網(wǎng)站（https://xena.ucsc.edu）[11]下載與之匹配的目的基因拷貝數(shù)變異及甲基化數(shù)據(jù)，旨在深入研究該基因表達上調的可能作用機制。

1.2 方法

1.2.1 患者分組：提取371例肝癌患者CCNB1 mRNA seqV2表達譜數(shù)據(jù)集及匹配的患者臨床病理資料，按照CCNB1表達水平，以中位數(shù)為截斷值，小于中位數(shù)的患者定義為CCNB1低表達組，反之則為高表達組。

1.2.2 富集分析：提取從cBioPortal數(shù)據(jù)庫下載的CCNB1共表達基因集[12]，篩選標準為：皮爾森系數(shù)≥0.8，共獲取95個共表達基因。然后，利用DAVID網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/）[13]進行基因本體論（gene ontology，GO）及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，并利用Cytoscape軟件進行富集結果比對。其中，GO分析結果包括三個部分，分別為細胞組分（cellular component，cc）、分子功能（molecular function，mf）、生物過程（biological process，bp）。

1.3 作圖及統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 6軟件作圖，采用SPSS 22.0版軟件進行統(tǒng)計分析。癌組織與正常組織間基因表達水平及甲基化水平的差異表達比較采用配對t檢驗；CCNB1基因表達水平與肝癌患者臨床病理學特征采用χ2檢驗；受試者工作特征曲線（ROC）用于評價指標診斷效能，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）；Kaplan-Meier法分別分析兩組患者的總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease-free survival，DFS），Log-Rank法檢驗；單因素及多因素Cox回歸模型評價各臨床病理學參數(shù)及CCNB1表達水平對肝癌患者預后的影響；線性回歸分析分析CCNB1表達與其DNA甲基化水平的相關性。以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCNB1在肝癌組織及正常肝組織中的差異表達及診斷價值

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫在線分析CCNB1基因在肝癌組織和正常肝組織中的表達水平，同時提取TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌組織（n=371）和正常肝組織（n=50）中CCNB1 mRNA seqV2表達譜數(shù)據(jù)，結果一致表明CCNB1在肝癌組織中表達水平明顯高于正常肝組織，二者差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001） （圖1A和B）。為研究CCNB1 mRNA在肝癌組織和肝組織中的蛋白表達水平，我們利用HPA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)CCNB1在正常肝組織（n=3）中無表達，肝癌組織（n=12）中有9例為中度表達，3例無表達（圖1D）。進一步利用ROC模型對該基因表達情況分析，結果顯示ROC曲線下面積AUC=0.9799，95%CI0.9673～0.9924，提示CCNB1對肝癌具有良好的診斷效能（圖1C）。

2.2 CCNB1 mRNA表達與肝癌患者臨床病理特征的關系

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的肝癌患者臨床病理資料，按照CCNB1 mRNA表達水平，以中位數(shù)為截斷值，將肝癌患者分為高表達組（n=186）和低表達組（n=185），并分析高/低組患者臨床病理資料間的差異。結果顯示：兩組患者的種族（P=0.005）、AFP表達水平（P＜0.0001）、病理分級（P＜0.0001）、血管侵襲（P＜0.0001）等之間有顯著統(tǒng)計學差異，但比較兩組患者年齡（P=0.123）、性別（P=0.337）、TNM分期（P=0.057）、Child-Pugh肝功能（P=0.062）等發(fā)現(xiàn)無明顯統(tǒng)計學差異。見表1。

2.3 CCNB1 mRNA表達與肝癌患者OS的關系

為了探究CCNB1 mRNA表達對肝癌患者生存預后的影響，利用Kaplan-Meier法進行高/低表達組與肝癌患者OS的生存分析，結果顯示CCNB1 mRNA高表達患者與其不良OS顯著相關（P=0.0015） （圖2A）。為進一步探究該基因表達對評估肝癌患者OS的預后價值，利用Cox比例風險模型進行了單因素和多因素分析。在單因素Cox回歸表明，CCNB1表達水平（P=0.001）、AFP表達水平（P=0.021）、TNM分期（P＜0.001）與肝癌患者OS顯著相關；在多因素Cox回歸分析進一步提示TNM分期（HR2.088，95%CI1.421～3.066，P＜0.001）、CCNB1 mRNA表達水平（HR1.544，95%CI1.052～2.266，P=0.027）是影響肝癌患者OS的獨立危險因素。見表2。

2.4 CCNB1 mRNA表達與肝癌患者DFS的關系

圖1A：CCNB1基因在多種腫瘤中的差異表達；B：CCNB1基因在肝癌組織（n=371）及正常肝組織（n=50）中表達比較；C：肝癌患者CCNB1基因表達的ROC曲線；D：CCNB1蛋白在正常肝組織（a）及肝癌組織（b）中的表達

表1 CCNB1表達與肝癌患者臨床病理特征的關系

與此同時，利用Kaplan-Meier法進行高/低表達組與肝癌患者DFS的生存分析，結果同樣表明，CCNB1 mRNA高表達患者與其不良DFS顯著相關（P=0.0004） （圖2B）。在單因素Cox回歸表明，CCNB1 mRNA表達水平（P＜0.001）、AFP表達水平（P=0.029）、TNM分期（P＜0.001）、血管侵襲（P＜0.001）與肝癌患者OS顯著相關；在多因素Cox回歸分析進一步提示TNM分期（HR1.849，95%CI1.292～2.645，P=0.001）、CCNB1 mRNA表達水平（HR1.793，95%CI1.277～2.517，P=0.001）及血管侵襲（HR1.608，95%CI1.127～2.294，P=0.009）是影響肝癌患者DFS的獨立危險因素（見表3）。

2.5 CCNB1 mRNA共表達基因集的GO分析和KEGG分析結果

為探討CCNB1基因參與肝癌形成的潛在機制，我們對CCNB1共表達基因進行聚類分析，以預測CCNB1的基因功能。利用DAVID在線分析工具進行富集分析，GO分析結果顯示，CCNB1共表達基因參與的生物過程（BP）包括細胞增殖、細胞周期調控、有絲分裂細胞周期的G1/S轉換、有絲分裂細胞周期的G2/M轉換、染色體分離、細胞分裂、DNA損失修復等；主要涉及的分子功能（MF）包括：染色質結合、微管運動、蛋白質結合等；主要涉及的細胞成分（CC）包括：細胞質、核質、染色體及著絲粒區(qū)域等。KEGG分析結果顯示，CCNB1共表達基因主要參與細胞周期調控、孕酮介導的卵母細胞成熟、p53信號通路等信號通路（圖3A）。同時利用Cytoscape軟件進行KEGG富集分析，分析結果與上述基本一致（圖3B）。這提示，CCNB1可能通過細胞周期調控、介導DNA損失及影響p53信號通路等參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

圖2A：CCNB1高表達和低表達肝癌患者OS生存曲線；B：CCNB1高表達和低表達肝癌患者DFS生存曲線

表2 影響肝癌患者OS的臨床病理因素的單因素和多因素分析

表3 影響肝癌患者DFS的臨床病理因素的單因素和多因素分析

2.6 CCNB1 DNA甲基化與其基因表達的關系

圖3A：CCNB1共表達基因的GO和KEGG通路分析；B：CCNB1共表達基因的通路富集分析

為深入探究該基因在肝癌中異常表達的潛在機制，我們利用UCSC xena網(wǎng)站進一步對371例TCGA肝癌組織及50例正常肝組織標本進行數(shù)據(jù)挖掘和分析。在所有肝癌組織標本（n=371）中，共364例組織同時包含CCNB1拷貝數(shù)變異（copy number alterations，CNAs）和CCNB1 mRNA表達數(shù)據(jù)（圖4A），其中，94例（25.8%）為復制子擴增（+1/+2），223例（61.2%）例拷貝數(shù)無改變（0），按其拷貝數(shù)變異情況，分為擴增組（+1/+2）和無改變組（0），進一步分析兩組病人組織CCNB1基因表達差異，結果表明擴增組患者CCNB1 mRNA表達明顯高于無改變組（圖4D），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。然后我們進一步分析CCNB1 mRNA表達與其DNA甲基化水平的關系，結果表明CCNB1在肝癌組織中有12個甲基化位點（圖4B），且在肝癌組織中甲基化明顯低于正常肝組織（P＜0.001） （圖4C），CCNB1 mRNA與其平均甲基化水平呈負相關（r=-0.1327，P=0.011，圖4E）。這提示CCNB1異常表達可能部分受其基因甲基化水平的調控。

3 討論

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，占全世界癌癥死亡人數(shù)的9%，而在發(fā)展中國家則高達12%[1]。目前肝癌治療方式主要包括手術切除、肝移植、消融治療及肝動脈化療栓塞術（TACE）等，盡管治療手段多樣，但肝癌發(fā)病較為隱匿，大多數(shù)被診斷時已處于中晚期，因此其整體預后仍欠佳。鑒于臨床上肝癌發(fā)病隱匿、易轉移和復發(fā)等特點，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對改善肝癌患者治療效果和提高患者生存率則尤為重要。眾所周知，AFP是原發(fā)性肝癌診斷中應用最為廣泛的一個腫瘤標記物，但其診斷敏感性和特異性并不高，分別為39%～64%和76%～91%[14]。因此仍需探尋新的分子靶標，提高肝癌患者的早期診斷和預后判斷，以期更為積極有效地改善肝癌患者預后。CCNB1表達的蛋白cyclin B1是成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF）的調節(jié)亞單位，其與MPF的催化亞單位細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）結合后，在G2/M期交接處發(fā)揮作用，驅動細胞周期時相轉換，是啟動有絲分裂的關鍵分子。作為細胞周期的重要調節(jié)因子，諸多研究發(fā)現(xiàn)CCNB1蛋白在多種腫瘤中呈現(xiàn)表達上調，且與患者不良預后顯著相關。Cooper等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CCNB1在非小細胞肺癌中表達明顯上調，且高CCNB1表達患者總生存率明顯低于低表達組。同樣地，Begnami等[7]發(fā)現(xiàn)CCNB1在胃癌中表達明顯上調且與患者不良預后顯著相關。鑒于CCNB1在人類腫瘤中普遍表達上調且與大多數(shù)腫瘤患者預后相關，筆者推測其可能成為潛在的癌癥檢測、治療及預后評估的重要靶標。然而，關于CCNB1在肝癌組織及肝癌患者臨床預后研究目前尚少，因此本文利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了CCNB1在肝癌組織中的異常表達水平及其與肝癌患者臨床預后相關性，同時探究了其在肝癌組織中異常表達的潛在機制。

圖4A：CCNB1基因拷貝數(shù)變異與基因表達的關系；B：CCNB1基因表達與其DNA甲基化水平的關系；C：CCNB1在肝癌組織和正常肝組織甲基化水平比較；D：CCNB1表達在不同拷貝數(shù)變異組肝癌患者中的比較；E：CCNB1 DNA甲基化平均水平與CCNB1表達水平的相關性分析結果

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，其主要受到細胞周期蛋白（Cyclins）、周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDKs）以及周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子（CKIs）等的調控。它們之間相互調控以完成對細胞周期的準確調控。既往文獻報道，Cyclins-CDKs-CKIs調節(jié)系統(tǒng)中的相關蛋白或基因的改變與腫瘤的發(fā)生關系極為密切[15-17]。近年來，有學者認為腫瘤實質上就是一類細胞周期疾病，其發(fā)生、發(fā)展與正常細胞周期的失調控密切相關。因此，深入研究以細胞周期相關基因為靶標的腫瘤治療有著廣闊的前景[18]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，無論是mRNA水平還是蛋白水平，CCNB1在肝癌組織表達均高于正常肝組織，且與肝癌患者不良OS和DFS明顯相關。分析CCNB1 mRNA與肝癌患者臨床病理特征間的關系發(fā)現(xiàn)，CCNB1 mRNA表達水平與患者種族、AFP水平、病理分級、血管侵襲等顯著相關。Cox回歸分析表明CCNB1高表達是影響肝癌患者臨床預后的獨立危險因素。為進一步深入探索CCNB1在肝癌中表達上調的機制，我們采用UCSC在線數(shù)據(jù)庫分析得出，其表達上調可能與CCNB1基因復制子擴增有關，且CCNB1 DNA甲基化部分參與調控該基因的表達。

Yuan等[19]研究發(fā)現(xiàn)沉默CCNB1可以顯著降低乳腺癌細胞（MCF-7、MDA-MB-435及BT-474）的增殖能力同時提高細胞的凋亡率。為了研究CCNB1異常表達是否影響肝癌細胞的生物學特征，張勇等[20]通過靶向CCNB1基因敲除技術，發(fā)現(xiàn)CCNB1基因敲除可以明顯增加肝癌細胞HepG2對化療藥物柔紅霉素的敏感性，CCNB1低表達的肝癌細胞克隆增殖能力顯著受到抑制，由此可知，HepG2的克隆增殖能力的確受到CCNB1高表達的影響。值得關注的是，通過抑制CCNB1表達不僅有效抑制肝癌細胞的能力增殖，還可增加其對化療藥物的敏感性。因此，探究CCNB1與肝癌的關系極具潛在的臨床價值。為了進一步探究CCNB1在肝癌中的重要作用，我們利用GO和KEGG富集分析探究了CCNB1共表達基因的生物學功能。結果表明，CCNB1共表達基因集主要參與細胞周期調控相關的功能如有絲分裂細胞周期的G1/S轉換、有絲分裂細胞周期的G2/M轉換、染色體分離、細胞分裂、DNA損失修復等，參與的調控通路包括細胞周期調控、孕酮介導的卵母細胞成熟、p53信號通路等。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)通過CCNB1沉默可以誘導p53再活化和調節(jié)凋亡相關蛋白，降低胰腺癌細胞的增殖能力，減少肝癌細胞S期比例，相反顯著增強了胰腺癌細胞的凋亡和衰老，提高了G0/G1期細胞比例。同樣，有文獻亦報道CCNB1的異常表達可通過p53信號通路等影響腫瘤的生物學效應[22-23]。有鑒于此，我們推測CCNB1亦可能通過上述機制參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，但仍需后續(xù)實驗予以佐證。

本研究利用生物信息學方法分析了CCNB1在肝癌患者中的表達并探究其在肝癌組織中異常表達的潛在機制，同時分析了其異常表達在肝癌患者中的臨床意義，為進一步研究CCNB1在肝癌中的基礎和臨床研究提供線索和依據(jù)，但仍需進一步予以佐證?；诖?，本實驗室將會進一步在細胞和動物水平上驗證CCNB1在肝癌中的具體作用機制，以期為肝癌的臨床診斷和治療提供新方向。