郝 夢(mèng)， 賈春燕， 盧 軍， 唐 梅， 趙宇涵， 李風(fēng)森, 姜 林

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第四臨床醫(yī)學(xué)院， 2藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

肺纖維化是指正常的肺泡組織被損壞以后進(jìn)行異常修復(fù)，最終導(dǎo)致肺泡組織結(jié)構(gòu)異常，是一種慢性并且不可逆的彌漫性肺間質(zhì)性疾病[1]。目前大部分肺纖維化病人的病因尚不明確，其病理改變是以肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)大量聚集增多以及肺泡間質(zhì)性炎癥為主[2]。近年來(lái)肺纖維化的發(fā)病率及死亡率逐年上升，目前還沒有其他能有效治療肺纖維化的藥物[3]，中西醫(yī)都在積極探索研究肺纖維化的發(fā)病機(jī)制以及治療方法，尋找有效的治療肺纖維化的藥物和防治手段，相比于西醫(yī)，中醫(yī)藥具有多成分、多靶點(diǎn)、副作用小的特點(diǎn)[4]。中醫(yī)多將肺纖維化歸屬于“肺痿”、“肺痹”等病證范疇，認(rèn)為氣虛血淤為其基本病機(jī)，故以補(bǔ)氣活血、祛痰通絡(luò)為組方原則組成金芪湯。金芪湯主要由黃芪、金銀花、石斛等藥材組成，具有益氣養(yǎng)陰、祛痰通絡(luò)、活血化瘀的功效，為新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院呼吸科的臨床經(jīng)驗(yàn)方，在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中表明該方具有良好的改善肺纖維化的作用。為進(jìn)一步優(yōu)化處方組成，增強(qiáng)療效，根據(jù)中醫(yī)組方原則和疾病的特點(diǎn)將原處方另拆分為四個(gè)不同組方，一并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)采用博來(lái)霉素(BLM)誘導(dǎo)建立大鼠肺纖維化模型，通過觀察肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量變化及肺組織病理學(xué)的改變，探討金芪湯不同組方對(duì)肺纖維化大鼠的治療作用，為金芪湯組方的確定及后續(xù)研究提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器光學(xué)顯微鏡(型號(hào): DM3000B，德國(guó)徠卡儀器有限公司)，電子天平(型號(hào)：京制00000246號(hào)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，酶標(biāo)儀(型號(hào)：MULTI-SKAN,美國(guó)Thermo Scientific公司)，低速離心機(jī)(型號(hào)：TDZ5WS,長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：Heraeus Multifuge X1R，賽默飛世爾科技公司)。

1.2 試藥與金芪湯組方成分BLM(海正輝瑞制藥有限公司，批號(hào)17047911)， HYP試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào): 20190521)，馬松(Masson)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20190128)。金芪湯組方1:黃芪、石斛、三棱、莪術(shù)、鹿銜草、木瓜；金芪湯組方2：金銀花、石斛、三棱、莪術(shù)；金芪湯組方3：黃芪、石斛；金芪湯組方4：黃芪、金銀花；金芪湯組方5：金銀花。金芪湯湯液生藥含量為 1 g /mL，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑研發(fā)實(shí)驗(yàn)室制備，藥材購(gòu)自湖北道地藥材科技有限公司。

1.3 動(dòng)物SD大鼠70只，體質(zhì)量(200±20) g，雌雄各半，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心。在潔凈級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，大鼠自購(gòu)入當(dāng)天開始常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 肺纖維化大鼠模型的建立 取SD大鼠70只，隨機(jī)抽取10只為空白組，其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉，將大鼠頸部絨毛剃除，仰臥固定于操作板，操作板下方鼠頭一側(cè)墊高30°，無(wú)菌條件下，縱向?qū)㈩i部皮膚剖開，鈍性分離，暴露氣管，用無(wú)菌注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙斜45°注入BLM (5 mg/kg) 復(fù)制肺纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停⑷牒罅⒓磳⒋笫罅⑵鸩⑿D(zhuǎn)，使藥物能在肺部均勻分布，縫合，碘液消毒(2～3次/d)，置于潔凈級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)觀察，14 d后給藥[5-6]。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及給藥方法 將模型建立成功的60只SD大鼠隨機(jī)分為模型組(生理鹽水6 mL/kg體質(zhì)量)、金芪湯組方1組(6.21 g/kg體質(zhì)量)、金芪湯組方2組(6.21 g/kg體質(zhì)量)、金芪湯組方3組(6.21 g/kg體質(zhì)量)、金芪湯組方4組(5.5 g/kg體質(zhì)量)、金芪湯組方5組(2.7 g/kg體質(zhì)量)，未建立模型的10只SD大鼠為空白組,共7組，每組10只，連續(xù)給藥28 d。

1.4.3 大鼠一般狀態(tài)觀察 觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀況、活動(dòng)情況、呼吸狀況、飲食飲水情況、體質(zhì)量及毛色等。

1.4.4 肺組織HYP含量測(cè)定 SD大鼠處死后，生理鹽水洗凈血液，取肺組織100 mg，采用堿水解法測(cè)定HYP含量，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照HYP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.5 蘇木素-伊紅(HE)染色 留取大鼠左肺上葉肺組織，于10%甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋、切片后，進(jìn)行HE染色檢測(cè)。光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片，比較分析各組大鼠肺組織肺泡炎程度，參照Szapiel的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定肺泡炎程度。

1.4.6 Masson染色 留取大鼠左肺上葉肺組織，于10%甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋、切片后，嚴(yán)格按照Masson染色試劑盒上的步驟進(jìn)行染色。光學(xué)顯微鏡觀察并攝片，比較分析各組大鼠肺組織膠原沉積情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)空白組大鼠精神狀態(tài)良好，四肢靈活，反應(yīng)迅速，呼吸順暢，無(wú)咳喘癥狀，飲食飲水情況正常，體質(zhì)量增加顯著，毛發(fā)茂密順滑有光澤。模型組大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲緩，呼吸短促伴有咳嗽、氣喘及嘶鳴聲，飲食飲水量較空白組大鼠明顯減少，術(shù)后1 w內(nèi)體質(zhì)量急劇下降，之后體質(zhì)量增加緩慢。與模型組相比，金芪湯各組的大鼠精神狀態(tài)較好，活動(dòng)量較多，呼吸較為平和，飲食飲水量稍多，體質(zhì)量術(shù)后1 w內(nèi)先急劇下降然后緩慢增加，增加量高于模型組，毛發(fā)較為茂密順滑。實(shí)驗(yàn)過程中空白組、模型組、金芪湯組方1組、金芪湯組方2組、金芪湯組方3組、金芪湯組方4組、金芪湯組方5組分別死亡0、3、3、2、2、3、3只。

2.2 各組大鼠肺組織HYP含量變化與空白組比較，模型組大鼠肺組織中HYP含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組大鼠相比，金芪湯組方2組、金芪湯組方3組大鼠肺組織中HYP含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，金芪湯組方1組、金芪湯組方4組、金芪湯組方5組大鼠肺組織中HYP含量降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肺組織HYP含量比較

注：與空白組比較，#P<0.05， 與模型組比較，*P<0.05。

2.3 HE染色結(jié)果空白組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，無(wú)明顯炎癥及纖維化特征，肺泡間隔未見增厚。模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔廣泛的縮小或消失，肺泡壁顯著增厚增寬，以大量膠原纖維增生、纖維組織為主，并存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。金芪湯各組大鼠肺組織分別與模型組比較，上述病理改變均有不同程度減輕，其中金芪湯組方2組與金芪湯組方3組改善較為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，金芪湯組方1組、金芪湯組方4組、金芪湯組方5組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖1。

表2 各組大鼠肺泡炎病理學(xué)積分情況

注：與空白組比較，#P<0.05， 與模型組比較，*P<0.05。

2.4 Masson染色結(jié)果空白組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整清晰，間隔未見增厚，有少量藍(lán)色的膠原纖維分布。與空白組相比，模型組肺泡間隔寬厚，可見大量藍(lán)色的膠原纖維沉積，顏色較深，彌漫性纖維組織形成；與模型組比較，各給藥組肺泡間隔較窄，藍(lán)色的膠原纖維沉積量減少，纖維化程度較輕。其中金芪湯組方2組與金芪湯組方3組改善較為明顯，見圖2。

a：空白組

b：模型組

c：金芪湯組方1組

d：金芪湯組方2組

e：金芪湯組方3組

f：金芪湯組方4組

g：金芪湯組方5組

圖1 各組大鼠肺組織HE染色比較(×200)

a：空白組

b：模型組

c：金芪湯組方1組

d：金芪湯組方2組

e：金芪湯組方3組

f：金芪湯組方4組

g：金芪湯組方5組

圖2 各組大鼠肺組織Masson染色比較(×200)

3 討論

肺纖維化預(yù)后不良，致死率高，西藥治療的副作用較為嚴(yán)重，所以開發(fā)中醫(yī)藥治療肺纖維化具有積極意義[7]。肺纖維化以肺泡間質(zhì)性炎癥、成纖維細(xì)胞大量增生、細(xì)胞外基質(zhì)聚集增多為主要病理改變。其臨床癥狀以逐漸加重的咳嗽、喘息、氣急為主[8]。肺纖維化動(dòng)物模型被廣泛用于肺纖維化發(fā)病機(jī)制及相關(guān)藥物的研究。BLM性質(zhì)比較穩(wěn)定，能被組織細(xì)胞所吸收，對(duì)肺臟的毒副作用明顯，是用于建立肺纖維化模型的常用誘導(dǎo)劑，其病理組織學(xué)改變與人類肺纖維化最為相似[9-12]。大鼠造模后肺部前期以炎癥為主，后期以纖維化為主。本實(shí)驗(yàn)采用氣管內(nèi)注入BLM的方法制備大鼠肺纖維化模型，造模14 d后，隨機(jī)抽取2只大鼠進(jìn)行病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)模型制備成功，開始給藥，以此來(lái)評(píng)價(jià)金芪湯各組藥物改善纖維化的作用。

金芪湯各組方能夠較好地改善BLM所致肺纖維化大鼠的精神狀態(tài)、靈敏度、呼吸狀況、飲食飲水情況、體質(zhì)量以及毛色等一般情況。 HYP在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中占極少量，其他蛋白中幾乎沒有[13]，可間接反映膠原含量和器官纖維化的程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組的HYP含量明顯增加，表明采用BLM氣管內(nèi)注入方法成功制備了大鼠肺纖維化模型。與模型組相比，金芪湯組方2組、金芪湯組方3組大鼠肺組織中HYP含量明顯降低，表明金芪湯組方2組、金芪湯組方3組能顯著降低肺組織內(nèi)膠原纖維含量，減輕肺纖維化程度。病理形態(tài)學(xué)觀察是研究肺纖維化病理發(fā)展過程最直觀顯著的指標(biāo)，本研究采用HE 染色和Masson染色觀察各組大鼠肺組織病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組大鼠肺組織呈現(xiàn)明顯的肺纖維化病理改變，與模型組相比，金芪湯組方2組、金芪湯組方3組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度明顯減輕。

綜上所述，金芪湯不同組方均能不同程度改善BLM致大鼠的肺纖維化程度。其中金芪湯組方2組、金芪湯組方3組能顯著降低BLM致肺纖維化大鼠肺組織HYP含量，減輕其肺泡炎及肺纖維化程度。臨床上肺纖維化的治療還沒有理想的藥物，本研究提示金芪湯組方2、組方3能顯著改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維程度，有望成為治療肺纖維化的候選藥物，但其作用機(jī)制有待研究。同時(shí)本研究也為金芪湯組方的確定及后續(xù)研究提供了依據(jù)。