杜 梨, 李 娜, 劉美琨, 王翰云, 張倩影, 王曼曼*, 王學(xué)生*

(1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 河北 唐山 063210; 2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院, 河北 唐山 063000)

在儀器分析之前,由于尿液成分復(fù)雜且BZDs含量低,需要采用液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)等技術(shù)進(jìn)行富集凈化。SPE是利用固體吸附劑吸附液體樣品中的目標(biāo)化合物,然后選擇性洗脫,而達(dá)到富集凈化復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物的一種前處理技術(shù)[9]。吸附劑作為其核心,決定了分析方法的時(shí)間、成本和準(zhǔn)確度。目前主要使用親水-親脂平衡柱、離子交換柱和C8/C18柱等商品化固相萃取柱[10,11]對尿液中BZDs進(jìn)行前處理?；谖絼┰诜治鲞^程中的重要作用,新型高效吸附劑的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。

有機(jī)聚合物整體柱是通過單體、致孔劑、交聯(lián)劑和引發(fā)劑等混合物的原位聚合得到的連續(xù)棒狀材料,具有制備簡單、性質(zhì)穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)多孔等特性[12]。與填充型吸附劑相比,它避免了裝填過程,使用時(shí)其多孔結(jié)構(gòu)易于傳質(zhì),提高了萃取效率,因而被廣泛用于樣品前處理領(lǐng)域[13]。李娜等[14]使用聚(乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體柱對血清中卡馬西平和10-羥基卡馬西平進(jìn)行前處理,結(jié)合高效液相色譜分析,檢出限為0.004 μg/mL和0.01 μg/mL,回收率為92.7%和94.2%。Yang等[15]采用聚(乙烯基苯硼酸-N,N-亞甲基雙丙烯酰胺)整體柱結(jié)合高效液相色譜對尿液中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行富集,富集因子高于17,檢出限為0.06～0.08 μg/L,回收率為81.0%～105.5%。

本研究以[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨(DAC)為單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑在注射器模具中制備聚(DAC-co-EDMA)整體柱,結(jié)合HPLC,建立簡單、高效的尿液樣品中3種BZDs的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1260型高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD,美國Agilent公司); Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡(日本日立公司); FTIR-8400S傅里葉紅外光譜儀(日本島津公司)。

80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DAC水溶液、乙酸乙酯(ethyl acetate,色譜純)和EDMA(純度98%)(上海阿拉丁試劑公司);甲醇(methanol, MeOH)和乙腈(acetonitrile, ACN)(色譜純,美國Thermo Fisher Scientific公司);醋酸銨(NH4Ac)、正丙醇、聚乙二醇400和偶氮二異丁腈(純度99%,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);丙酮(acetone,唐山市路北區(qū)化工廠);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司); ProElut C18固相萃取柱(60 mg/3 mL,北京迪馬科技發(fā)展公司);一次性聚乙烯無菌注射器(2 mL,江西豐臨醫(yī)用器械有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:溴西泮(bromazepam, BRZ,純度99.9%)、勞拉西泮(lorazepam, LRZ,純度99.9%)和地西泮(diazepam, DZP,純度99.9%)的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)均購自美國Cerilliant公司,其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 3種苯二氮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2 聚(DAC-co-EDMA)整體柱的制備

圖2為聚(DAC-co-EDMA)整體柱的合成示意圖。量取35 μL DAC、500 μL EDMA、1 mL正丙醇、500 μL聚乙二醇400和50 μL H2O，混合均勻后,加入8 mg偶氮二異丁腈,超聲混合均勻。取500 μL該溶液灌入一端封口的2 mL注射器中,密封后于55 ℃水浴條件下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后使用MeOH沖洗,得到聚(DAC-co-EDMA)整體柱。

圖2 聚(DAC-co-EDMA)整體柱的合成示意圖

1.3 尿液樣品的采集和制備

采集4例口服1 mg LRZ患者9 h[16]后的尿液樣品,使用H2O稀釋(尿液∶H2O=3∶1, v/v)后[8],以1 500 r/min離心10 min,收集上清液。采集若干名未服用BZDs的健康志愿者尿液作為對照樣品,處理方法同上。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 固相萃取

使用MeOH和H2O各2 mL，平衡聚(DAC-co-EDMA)整體柱,上樣4 mL尿液樣品,加壓使其以1 mL/min的流速流出,用4 mL H2O沖洗, 1 mL乙酸乙酯洗脫,將收集的洗脫液于35 ℃、34 kPa條件下氮吹濃縮至干,使用MeOH復(fù)溶至0.2 mL,過濾,進(jìn)行HPLC分析。

1.5 HPLC條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫35 ℃;流動(dòng)相為(A)H2O和(B)MeOH;流速為1 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)?～5.0 min, 62%B; 5.0～13.0 min, 62%B～80%B。進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:228 nm。

圖3 (a)聚EDMA整體柱、聚(DAC-co-EDMA)整體柱的紅外光譜圖和(b)聚(DAC-co-EDMA)整體柱的掃描電鏡圖(×5000)

2 結(jié)果與討論

2.1 聚(DAC-co-EDMA)整體柱的構(gòu)筑和表征

圖3a為聚EDMA和聚(DAC-co-EDMA)整體柱的紅外光譜圖,與聚EDMA整體柱相比,聚(DAC-co-EDMA)整體柱在1 456 cm-1和950 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為銨甲基C-H彎曲振動(dòng)峰和季銨基團(tuán)C-N伸縮振動(dòng)峰,在1 732 cm-1和2 881 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為C=O伸縮振動(dòng)峰和=C-H伸縮振動(dòng)峰[17],說明DAC與EDMA成功聚合。將聚(DAC-co-EDMA)整體柱進(jìn)行掃描電鏡表征,圖3b表明該柱具有均勻的孔結(jié)構(gòu),作為吸附劑使用時(shí),有利于降低物質(zhì)的傳質(zhì)阻力,并提高吸附效率。

實(shí)驗(yàn)選擇BZDs為探針目標(biāo)物。固定反應(yīng)溫度為55 ℃,考察聚合時(shí)間為2、3、4和5 h構(gòu)筑的整體柱對3種BZDs吸附性能的影響(見圖4)。隨著聚合時(shí)間的延長,3種BZDs的吸附效率逐漸提高,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間增加到4 h時(shí),吸附效率達(dá)100%,繼續(xù)增加聚合時(shí)間至5 h后,3種BZDs的吸附效率無明顯變化,因此實(shí)驗(yàn)最終選擇整體柱的聚合時(shí)間為4 h。

圖4 聚合時(shí)間對3種苯二氮類藥物吸附效率的影響(n=3)

實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察聚EDMA整體柱對3種BZDs的吸附效率,在相同吸附條件下,聚EDMA整體柱對BRZ、LRZ和DZP的吸附效率分別為39.0%、26.3%和92.8%,而聚(DAC-co-EDMA)整體柱對3種BZDs的吸附效率均達(dá)100%。聚EDMA柱床具有疏水性[18],對脂水分配系數(shù)(logP)在2.2～4.0范圍內(nèi)的3種BZDs藥物具有一定的吸附作用。當(dāng)引入DAC單體后,整體柱柱床增加的銨基提供了離子交換基團(tuán),對于pKa在1.3～3.3范圍內(nèi)的3種BZDs而言，吸附作用顯著提高至100%。

以吸附效率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評價(jià)同一批次(n=3)和不同批次(n=3)制備的聚(DAC-co-EDMA)整體柱的重復(fù)性,批次內(nèi)和批次間的RSD分別為1.7%～2.8%和3.0%～7.6%。該整體柱重復(fù)使用15次,以3種BZDs的吸附效率計(jì)算RSD,結(jié)果均≤8.9%。以上結(jié)果表明,該柱制備簡單,用時(shí)短,吸附效率高且重復(fù)性良好。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

固相萃取的淋洗和洗脫步驟決定了該方法的準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)固定上樣體積為4 mL,上樣含量為50 ng/mL,考察淋洗溶液和洗脫溶劑種類對3種BZDs回收率的影響。

圖5 (a)淋洗溶液和(b)洗脫溶劑對3種BZDs回收率的影響(n=3)

2.2.1淋洗溶液種類

淋洗的目的是保留目標(biāo)物的同時(shí)最大限度地去除雜質(zhì),因此淋洗液的選擇至關(guān)重要。以健康志愿者尿液樣品分析,固定淋洗溶液體積為4 mL,洗脫溶劑為1 mL乙酸乙酯,考察了H2O、ACN-H2O(5∶95, v/v)、NH4Ac溶液(25 mmol/L, pH=5)和0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl水溶液的淋洗效果。以上4種淋洗液對雜質(zhì)的去除率均達(dá)到90%以上,但當(dāng)使用H2O作為淋洗液時(shí),3種BZDs的回收率最高(見圖5a)。因此實(shí)驗(yàn)選擇H2O作為淋洗溶液。

2.2.2洗脫溶劑的種類和體積

洗脫條件決定了方法的準(zhǔn)確度,實(shí)驗(yàn)固定淋洗溶液為4 mL H2O,洗脫體積為1 mL,考察4種洗脫溶劑(丙酮、ACN、MeOH和乙酸乙酯)對目標(biāo)物的洗脫效果。當(dāng)洗脫溶劑為乙酸乙酯時(shí),3種BZDs的洗脫效果最佳,回收率為97.3%～105%(見圖5b);繼續(xù)增加洗脫體積,會(huì)延長氮吹濃縮的時(shí)間。因此,實(shí)驗(yàn)最終選擇1 mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫。

2.3 聚(DAC-co-EDMA)整體柱的富集凈化效果

為了評價(jià)聚(DAC-co-EDMA)整體柱對尿液中BZDs的富集凈化效果,對BZDs標(biāo)準(zhǔn)溶液(750 ng/mL)(見圖6a)和加標(biāo)50 ng/mL尿液樣品進(jìn)行分析。如圖6b所示,尿液樣品直接進(jìn)樣分析時(shí),雜質(zhì)的信號超過2 500 mAU, 3種BZDs的響應(yīng)信號低,無法定量。當(dāng)經(jīng)過聚(DAC-co-EDMA)整體柱富集和凈化后(見圖6c),雜質(zhì)的信號明顯降低,各目標(biāo)物均得到有效富集,富集倍數(shù)為12～15倍,回收率為86.9%～102%。將尿液樣品經(jīng)商品化C18固相萃取柱前處理(見圖6d), 3種BZDs的回收率為68.1%～114%,并且雜質(zhì)響應(yīng)信號明顯高于聚(DAC-co-EDMA)整體柱的凈化結(jié)果。說明聚(DAC-co-EDMA)整體柱凈化效果更佳。

圖6 (a)BZDs標(biāo)準(zhǔn)溶液(750 ng/mL)以及加標(biāo)尿液樣品(50 ng/mL)(b)直接進(jìn)樣、(c)經(jīng)本方法處理和(d)經(jīng)C18固相萃取柱處理的色譜圖

表1 3種BZDs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率和精密度

y: peak area;x: mass concentration, ng/mL.

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1線性范圍、檢出限和定量限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,在4.0～1 000 ng/mL范圍內(nèi)配制一系列3種BZDs的標(biāo)準(zhǔn)溶液(n=7)進(jìn)行分析,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(x, ng/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1)。結(jié)果表明,3種BZDs在4.0～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999。

對健康志愿者的尿液樣品分析,按信噪比(S/N)=3和S/N=10分別計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果分別為1.0～1.2 ng/mL和3.3～4.0 ng/mL。

2.4.2回收率和精密度

為了驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和精密度,以健康志愿者的尿液為樣品,加標(biāo)10、25和50 ng/mL 3個(gè)水平進(jìn)行分析(n=3)。如表1所示,3種BZDs的回收率為81.4%～102%,日內(nèi)和日間精密度(n=3)分別為1.2%～4.5%和2.5%～8.3%。表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.5 實(shí)際樣品分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性,使用聚(DAC-co-EDMA)整體柱,結(jié)合HPLC測定4例服用LRZ患者的尿液樣品。在4例患者的尿液樣品中均檢出了LRZ,含量為(72.1±1.6)～(85.2±3.2) ng/mL,加標(biāo)回收率(加標(biāo)水平為50 ng/mL)為78.2%～98.3%, RSD≤5.0%。

3 結(jié)論

本研究制備了聚(DAC-co-EDMA)整體柱,并結(jié)合HPLC建立了檢測尿液中3種BZDs的方法。方法線性范圍寬,靈敏度和回收率高。該整體柱制備簡單,富集凈化能力高效,為尿液中BZDs的臨床檢測提供了一種新方法。