章 豪, 吳銀良, 張宜文, 許秀琴, 徐 峰

(1.寧波市農業(yè)科學研究院, 農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室(寧波), 浙江 寧波 315040;2.北京市計量檢測科學研究院, 北京 100012)

頭孢類藥物屬于廣譜抗生素,臨診應用的頭孢類藥物均為半合成物質,殺菌力強,較青霉素類穩(wěn)定,目前已發(fā)展到第五代[1]。然而過量使用頭孢類藥物會對人體健康帶來潛在的危害,對兒童、老人,特別是胎兒的影響更大,嚴重者會導致胎兒病變、畸形、流產甚至死亡[2,3]。由于細菌產生耐藥性和過敏反應等原因,目前我國已制定了頭孢類藥物的最高殘留限量:頭孢氨芐在牛肌肉、肝、腎、脂肪和奶中的最高限量分別為200、200、1 000、200和100 μg/kg;頭孢喹肟在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪和牛奶中的最高限量分別為50、100、200、50和20 μg/kg;頭孢噻呋在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪、牛奶中的限量分別為100、200、600和200 μg/kg,其中頭孢噻呋的殘留量以其代謝產物呋喃甲?；^孢噻呋檢測含量計算[4]。但目前頭孢類藥物在蜂產品中暫無限量規(guī)定。

目前對包括頭孢類藥物在內的β-內酰胺類藥物殘留分析的方法主要有液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[5-18]、高效液相色譜法(HPLC)[19-24]、毛細管電泳法[25,26]和微生物法[27]。20世紀90年代以后,絕大多數(shù)生物有機體中的β-內酰胺類藥物殘留分析采用液相色譜進行測定。然而使用液相色譜法測定時存在的主要問題是未經(jīng)衍生化測定時,基體干擾較大;而經(jīng)衍生化測定后靈敏度雖有所提高,但也只能作為一種篩選方法進行使用,對于分析多種頭孢類藥物仍存在極大難度。而超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)是一種集多組分定性、定量和高效分離于一體的系統(tǒng),用于分析蜂產品中頭孢類藥物不僅能夠顯著提高方法的靈敏度和定性的準確度,而且能夠降低前處理的成本和工作量[28]。而不論是采用HPLC還是UPLC-MS/MS方法測定,通常都采用固相萃取小柱進行樣品的凈化和富集[6,8,13]。根據(jù)頭孢類藥物的相關報道[29,30],考慮到藥物的理化特性,前處理中凈化一般選用Oasis HLB固相萃取小柱,且凈化過程往往需要活化、淋洗和洗脫等費時費力的步驟。近來,Oasis PRIME HLB固相萃取小柱簡單快速的通過式凈化方案被用于快速有效地去除食品基質中的各種主要干擾物,包括脂肪、磷脂以及色素等[28]。Oasis PRIME HLB固相萃取小柱省去傳統(tǒng)的活化、平衡步驟,樣品經(jīng)提取后直接過柱,這種樣品凈化方法簡單、快速、有效,適合大批量日常分析檢測,但目前并未發(fā)現(xiàn)有相關文獻報道采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱用于蜂產品抗生素的樣品前處理。

本研究采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱,通過對樣品前處理方法和儀器條件進行優(yōu)化,建立了基于UPLC-MS/MS測定3類主要蜂產品(蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉)中頭孢類藥物殘留的分析方法。該方法檢測周期短,準確度和精密度高,能滿足多種蜂產品樣品中頭孢類藥物的檢測需要。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC XevoTMTQ-S micro超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀,配有電噴霧離子源(ESI)及MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司);低溫高速離心機(德國Sigma公司); Vortex Genie 3漩渦振蕩器(德國IKA公司)。

頭孢類藥物標準品(頭孢匹林、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢乙腈、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟、去乙?；^孢匹林、頭孢噻肟,純度均大于95%,德國Dr.Ehrenstorfer公司);甲酸(色譜純,美國Tedia公司);乙腈、甲醇(色譜純,德國Merck公司); Oasis PRIME HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL,美國Waters公司);實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 實驗條件

1.2.1標準溶液配制

分別準確稱取適量(精確至0.1 mg)10種頭孢類藥物標準品，用30%(v/v)乙腈水溶液溶解,配制質量濃度為1 g/L的標準儲備液,于-20 ℃ 保存；分別準確吸取1 mL標準儲備液,置于100 mL容量瓶中,用30%(v/v)乙腈水溶液稀釋,配制質量濃度為10 mg/L的混合標準儲備液,于-20 ℃保存。

基質匹配標準溶液：采用1.2.2節(jié)樣品處理方法制備空白蜂產品樣品溶液,稀釋混合標準儲備液,制備基質匹配標準溶液。

1.2.2樣品處理

稱取蜂蜜樣品約5.00 g、蜂王漿樣品約2.50 g、蜂王漿凍干粉樣品約1.00 g(精確至0.01 g),分別置于50 mL離心管中,分別加入乙腈-水(80∶20, v/v)溶液20 mL,渦旋振蕩1 min。蜂蜜樣品直接移取溶液,蜂王漿、蜂王漿凍干粉樣品以9 500 r/min高速離心5 min,移取上清液至Oasis PRIME HLB固相萃取小柱,收集全部流出液,流出液在40 ℃下氮氣吹干;用1 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(95∶5, v/v)溶液溶解,渦旋振蕩,過0.22 μm濾膜,用于UPLC-MS/MS分析。

1.2.3色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～4.5 min, 5%B～50%B; 4.5～6.0 min, 50%B; 6.0～6.1 min, 50%B～5%B; 6.1～7.5 min, 5%B;流速0.30 mL/min;進樣量10 μL。

1.2.4質譜條件

多反應離子監(jiān)測模式(MRM); ESI源正離子模式電離;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;錐孔氣流速:50 L/h;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;毛細管電壓:2.0 kV; RF透鏡電壓:0.5 V;萃取錐孔電壓:25 V;頭孢類藥物的相關參數(shù)見表1。

2 結果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

基于LC-MS/MS測定頭孢類藥物殘留大多采用ESI源正離子模式電離的分析方法[5-18]。本實驗采用甲醇-水(5∶95, v/v)溶液分別配制10種頭孢類藥物標準溶液(2.0 mg/L),利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀自帶的Intellistart軟件分別獲得10種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量(見表1),發(fā)現(xiàn)它們在正離子模式下均獲得了較好的響應。

表1 10種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量

* Quantitative ion.

本實驗考察了乙腈和甲醇作為色譜流動相的有機相時頭孢類藥物的分離效果,發(fā)現(xiàn)當采用乙腈作為有機相時,頭孢哌酮、頭孢乙腈等頭孢類藥物的響應較差,而采用甲醇作為有機相時,10種藥物的響應均較好,因此確定甲醇為有機相。

2.2 前處理條件優(yōu)化

生物樣品中頭孢類藥物的常用溶劑有甲醇[5]、甲醇-水[9]和乙腈-水[5,6,13]等。因蜂產品特別是蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品中通常含有蛋白質和磷脂類物質,用甲醇或甲醇-水溶解時樣液較混濁,需進一步凈化去除蛋白質。而用乙腈溶解時,因蛋白質變性沉淀,溶解后雜質少,且溶劑澄清,根據(jù)相關文獻報道,目前用于動物性食品溶解的乙腈溶液中乙腈含量均高于60%[5,12,19],因此本研究使用乙腈、乙腈-水(80∶20, v/v)和乙腈-水(60∶40, v/v)3種溶劑對蜂產品在200 μg/kg加標水平下進行溶解上樣,結果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水(60∶40, v/v)上樣時,不能使所有頭孢類藥物的回收率達到75%以上;而采用乙腈-水(80∶20, v/v)上樣時,所有頭孢類藥物的回收率均大于75%;采用乙腈上樣時,所有頭孢類藥物的回收率大于75%,但考慮到乙腈的強洗脫能力,樣品以及小柱中所含的雜質也會一起被洗脫下來,失去了過柱凈化的目的,因此確定以乙腈-水(80∶20, v/v)進行溶解上樣。

2.3 固相萃取小柱的選擇

本實驗對Oasis PRIME HLB和Oasis HLB兩款固相萃取小柱進行了比較。我們在蜂產品中選取最為主要的蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉3類基質進行試驗,從每一類基質中選取代表樣品進行添加回收試驗,其中,蜂蜜中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種頭孢類藥物的添加水平為4、20、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為1、20、200 μg/kg;蜂王漿中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種藥物的添加水平為8、40、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為2、20、200 μg/kg;蜂王漿凍干粉中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種藥物的添加水平為20、50、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為5、50、200 μg/kg。結果表明,樣品采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化后的回收率(75.0%～89.8%)均優(yōu)于采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化的結果(60.0%～71.0%)。結果還顯示,在無需活化、淋洗和洗脫等復雜的步驟下,樣品采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化后,無論是在回收率還是基質干擾方面,均優(yōu)于采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化的結果。這可能是因為對于蜂產品特別是蜂王漿和蜂王漿凍干粉中的磷脂和蛋白質等雜質,相比Oasis HLB固相萃取小柱,Oasis PRIME HLB固相萃取小柱可以更好地吸附這些雜質,不僅無需活化、淋洗和洗脫等這些費時費力的前處理步驟,在顯著縮短凈化時間的同時還能延長色譜柱的使用壽命[31,32]。因此本實驗采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱作為凈化小柱。

2.4 基質效應、標準曲線、檢出限和定量限

基質效應主要是由于樣品在離子化時基質成分與目標化合物相互競爭電離所致,包括基質增強效應和基質抑制效應。在UPLC-MS/MS定性定量分析中,基質效應會對儀器的靈敏度和重復性產生影響,進而影響檢測結果的準確性。本實驗采用(基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率)×100%的計算方法對10種頭孢類藥物在蜂產品基質中的基質效應進行考察。當結果大于100%時表示存在基質增強效應,小于100%時表示存在基質抑制效應,結果越接近100%基質效應越小。由表2可以看出,蜂產品有明顯的基質增強作用,10種頭孢類藥物均存在不同程度的基質增強效應。為了能更準確地測定目標化合物,本實驗采用基質匹配標準曲線來消除基質效應。采用蜂產品空白基質液配制1～1 000 μg/L橫跨3個數(shù)量級的系列基質標準工作溶液(其中頭孢乙腈、頭孢哌酮和頭孢唑林為5～1 000 μg/L)進行UPLC-MS/MS測定分析,以峰面積對相應質量濃度作標準曲線,得到線性回歸方程和相關系數(shù)(r2),如表2所示。10種頭孢類藥物在相應濃度范圍內的r2均大于0.999,線性關系良好。按3倍信噪比(S/N=3)計算,10種頭孢類藥物的檢出限(LOD)為0.15～1.5 μg/kg;按S/N=10計算,10種頭孢類藥物的定量限(LOQ)為0.50～5.0 μg/kg。農業(yè)部235號公告規(guī)定頭孢喹肟、頭孢氨芐在動物性食品中的最大殘留限量為20～1 000 μg/kg,而本方法檢出限低至0.15～1.5 μg/kg,因此能滿足蜂產品中頭孢類藥物含量分析的需要。

表2 10種頭孢類藥物在不同基質中的標準曲線、相關系數(shù)、檢出限、定量限和基質效應

表2 (續(xù))

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率與精密度

選取蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉3類基質進行添加回收試驗,計算相對標準偏差(RSD),結果見表3。頭孢類藥物在蜂蜜空白樣品中的加標MRM色譜圖見圖1。蜂蜜中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林的添加量為4 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加量為1 μg/kg,每批次同一水平5個平行樣品,重復測定3次。

由表3可知,10種頭孢類藥物的加標回收率為75.0%～89.8%,RSD為1.4%～4.6%。上述結果表明,該方法對測定蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉中10種頭孢類藥物的殘留均具有較好的準確度和精密度。

表3 10種頭孢類藥物在蜂蜜、蜂王漿、蜂王漿凍干粉中的回收率和相對標準偏差(n=5)

表3 (續(xù))

圖1 蜂蜜加標樣品的MRM色譜圖

2.6 方法應用

采用優(yōu)化后的儀器條件和前處理條件分別對隨機采集的50個蜂產品(含蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉)樣品進行分析,均未檢出上述10種頭孢類藥物。我們參照GB/T 22942-2008《蜂蜜中頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》對實際樣品進行了復測,結果一致。

3 結論

本工作建立了同時分析蜂產品中10種頭孢類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法,樣品經(jīng)乙腈-水(80∶20, v/v)溶液提取后離心,上清液經(jīng)Oasis PRIME HLB固相萃取柱凈化,氮吹后復溶進樣分析。方法具有精密度和準確度高、檢測周期短的優(yōu)點,能滿足蜂產品中10種頭孢類藥物含量分析的需要。