趙 楠, 程孟春, 吳玉林,3, 劉 丹, 張曉哲*

(1.中國科學院分離分析化學重點實驗室, 中國科學院大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2.中國科學院大學, 北京 100049; 3.河南中醫(yī)藥大學, 河南 鄭州 450046)

多肽是由2～100個氨基酸以不同組成和排列方式構成的相對分子質量范圍為200 Da至10 000 Da的分子[1]。天然存在的多肽廣泛參與人體多種生理過程的調控,充當神經遞質、激素、生長因子和抗生素等,具有重要的生物學功能[2,3]。食物來源多肽與人體內源肽結構類似,因此它們可與人體相同受體相互作用以發(fā)揮相應的生理功能[4]。食源多肽可以來自蛋白質水解的穩(wěn)定肽,也可來自動物、植物原生肽。植物多肽在植物的生長、發(fā)育、繁殖、防御和應激反應中發(fā)揮著各種各樣的天然功能[5]。迄今,已報道被分離的上百種植物多肽,如寡肽、環(huán)肽、環(huán)肽生物堿、糖肽等,從不同角度展現出可喜的生物活性[6],開發(fā)前景廣闊。因此,對植物多肽分子的全面分析不僅可以更好地理解系統(tǒng)生物學,且有助于藥用食品(營養(yǎng)保健品)、藥品和改良作物的生產[7]。

多肽組學是生物樣品中多肽類物質的綜合分析,其目標是系統(tǒng)、全面、定性和定量地研究生物體內源多肽的組成、功能及變化[8],被稱為蛋白質組學的“邏輯續(xù)集”[9]。目前,多肽組學已被廣泛用于生物標志物發(fā)現、疾病早期診斷、生物制藥等諸多領域[10,11]。然而,多肽組學很少用于中藥特別是植物藥的質量控制。生物內源多肽結構多樣、含量與分子質量動態(tài)范圍寬泛、內源多肽與代謝物和脂質共存且相對分子質量范圍重疊,使得多肽組學分析成為分析化學領域的重大挑戰(zhàn)[1]。盡管已有多種分析手段被用于多肽組學,但目前液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)技術由于結合了色譜強大的分離功能和質譜的高靈敏、高通量、高選擇性,已經逐漸成為多肽組學研究的主流技術。國內外研究者目前已將LC-MS技術應用于動、植物活性組分、肉制品真實性鑒定等食物來源多肽的研究[12,13]。

人參為五加科(Araliaceae)多年生草本植物人參PanaxginsengC.A.Meyer的干燥根和根莖,被列為全球最受歡迎的天然產物,作為草藥、食品添加劑以及保健品使用[14]。人參具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗抑郁、神經保護等多種生物活性[15,16]。2015版《中國藥典》收載人參根及根莖均為人參藥用部位[17];并按不同形態(tài)區(qū)域將人參劃分成4個部位,即主根、支根、須根和蘆頭。人參市場中常將上述4個部位分別銷售,且市場價值差異較大。因此,闡明人參不同部位的化學差異對于人參的鑒定、藥用和質量控制都具有重大意義。

目前已經進行了大量研究以評價人參不同部位的化學差異,但大多數研究僅局限于人參主要活性成分人參皂苷類[18-20]。然而除人參皂苷外,人參還富含多種非皂苷類成分,如多糖、蛋白質、多肽、聚乙炔、揮發(fā)油、黃酮、脂肪酸和氨基酸等[21]。隨著人參研究不斷深入,人參非皂苷類成分也顯示出人參藥效相關活性。全面描述人參中所有化學成分對人參在全球健康市場中獲得科學有效性至關重要[22]。近年來,人參內源性多肽因其良好的藥理學性質,如抗炎、鎮(zhèn)痛、神經保護、記憶增強、增殖、抗脂解和調節(jié)睡眠等作用受到越來越多的關注[23-26]。本團隊建立了一種基于納升液相色譜-質譜(nano-LC-MS)的多肽組學方法,通過數據挖掘和從頭測序,結合不同的質譜碎裂方式,對人參提取物中的人參多肽進行全面表征[27]。本研究采用基于超高效液相色譜-高分辨質譜(UPLC-HRMS)的多肽組學技術對人參多肽類成分進行全面分析,表征了人參多肽的結構;建立了模式識別模型用于人參主根、支根、須根和蘆頭多肽的差異分析,找到不同部位存在的差異多肽,并篩選出人參多肽標志物,為進一步的藥理學研究和臨床應用提供了理論依據,并為人參質量控制及合理開發(fā)、應用提供了新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290 Infinity超高效液相色譜儀、6520四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用儀(Q-TOF-MS,美國Agilent公司); ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters公司)、二維線性離子阱靜電場軌道肼組合式高分辨質譜儀(LTQ-Orbitrap-MS,美國Thermo公司); Milli-Q超純水儀(美國Milli-pore公司); YQ-1000C型超聲儀(上海易超凈公司); 1-16K型微型冷凍離心機(德國Sigma公司)。

甲醇和乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;甲酸(色譜純)購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

本研究共收集來自吉林省集安市4～6年新鮮園參樣本49例,全部為大馬牙型。樣品均有專人采集,并由專業(yè)人士進行嚴格的品種鑒定。

1.2 樣品前處理

將鮮園參樣品的不同形態(tài)區(qū)域(主根、支根、須根和蘆頭)分別風干、研磨和過篩以獲得均勻粉末。精密稱取各粉末100 mg置于2 mL離心管中,加入1 mL 50%(v/v)甲醇水溶液渦旋混合30 s,然后超聲提取30 min,并以12 000 r/min高速離心20 min,吸取上清液并過0.22 μm過濾器。

質量控制(QC)樣品由每個實際樣品提取液(49×4)等體積(50 μL)混合制備而成,以提供代表性樣品,用于監(jiān)控儀器的靈敏度和穩(wěn)定性。為表征人參多肽成分,分別吸取上述人參主根(n=49)、支根(n=49)、須根(n=49)、蘆頭(n=49)提取液,每份50 μL分別混合制成人參主根、支根、須根和蘆頭混合提取液,在氮氣流下吹干,并用500 μL含0.1%(v/v)甲酸的20%(v/v)乙腈水溶液復溶。

1.3 實驗條件

1.3.1UPLC-QTOF-MS條件

色譜條件 采用ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18反相色譜柱(150 mm×3.0 mm, 1.8 μm, Agilent,美國)。柱溫為60 ℃;進樣體積為5 μL。流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動相B為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序:0～15.0 min, 5%B～100%B。流速為0.4 mL/min。

質譜條件 ESI源,采用正離子模式;毛細管溫度為350 ℃,干燥氣流速為8 L/min,霧化氣壓力為276 kPa (40 psi),毛細管電壓為3.5 kV, Fragmentor電壓為200 V, Skimmer電壓為65 V;全掃描模式,質譜掃描范圍為m/z50～3 000。

樣本序列運行采用隨機進樣方式。實際樣品運行前連續(xù)5次進樣QC樣品,用于平衡儀器;實際樣品運行中,每20個人參樣品插入1個QC樣品和溶劑空白樣品。

1.3.2UPLC-LTQ-Orbitrap-MS條件

色譜條件 同1.3.1節(jié)。

質譜條件 ESI源,正離子模式檢測;分辨率設置為120 000;一級數據采集格式為profile,二級數據采集格式為centroid;一級全掃描質量范圍為m/z300～2 000;霧化電壓為2.0 kV;選擇一級質譜圖中前5個豐度最高的多電荷離子做二級碎裂;二級質譜碎裂方式為碰撞誘導解離(CID)和高能碰撞誘導解離(HCD),其中歸一化的碰撞能量根據需要設定為25%、30%和35%。

1.4 多肽序列分析

將獲得的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS原始數據導入蛋白質組學質譜軟件Peaks Studio 7進行過濾、解卷積、二級質譜圖簡化及從頭測序。具體參數設定:數據過濾閾值為數據品質值大于0.3;過濾后的數據進行自動從頭測序,母離子誤差<10×10-6,子離子誤差<0.5 Da,裂解不指定酶的參與;設定可能的翻譯后修飾(PTM): Amidation(Δmass, -0.98), Acetylation (N-terminal)(Δmass,+42.01), Pyroglutamalytion from E(Δmass, -18.01), Pyroglutamalytion from Q(Δmass, -17.03), Methylation from KR(Δmass,+14.02), Disulfide bond(Δmass, -1.01,設定發(fā)生位置:C), Dehydration(Δmass, -18.01), Deamidation (NQ)(Δmass,+0.98), Carboxylation (E)(Δmass,+43.99), Oxidation from M(Δmass,+15.99)和Hexose(Δmass,+162.05)等;以Swiss-Prot和TrEMBL數據庫的人參蛋白質數據庫為范圍進行數據庫檢索,該數據庫從www.uniprot.org網站下載。搜索鑒定的假陽性率(FDR)<1%;對搜索和測序得到的肽序列結合其可信度(-10lgP)、肽鏈斷裂情況、子離子的分配情況及誤差范圍逐個進行人工分析確認。

1.5 數據處理

將獲得的UPLC-QTOF-MS原始數據導入Progenesis QI軟件進行峰提取、峰對齊等數據處理,以獲得包括所檢測特征的tR-m/z對、m/z、tR、離子強度和電荷狀態(tài)(z)的數據表。主要參數設置如下:數據強度過濾閾值為0.3;噪聲消除水平為絕對強度1 000;保留時間范圍為1.5 min至15 min。數據結果以CSV文件格式輸出。

將含有經人參蛋白質數據庫鑒定的人參多肽數據表導入SIMCA-P軟件,進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)等多變量統(tǒng)計分析,多變量分析之前使用Pareto縮放。采用在線數據處理軟件MetaboAnalyst 4.0(http://www.metaboanalyst.ca)進行倍數變化(FC)和T檢驗分析,分別獲得FC值和p值。使用SPSS 20.0軟件計算受試者工作特征曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)。為滿足生物學重復性,所有多肽標志物均符合“50%原則”要求。

2 結果與討論

2.1 人參多肽表征

二維線性離子阱靜電場軌道肼組合式高分辨質譜儀結合了線性離子阱質譜的多級掃描和靜電場軌道阱質譜的超高分辨能力,可提供多肽的精確相對分子質量、氨基酸序列、翻譯后修飾及位點等高質量質譜信息。Peaks Studio是基于前體蛋白質數據庫及一級和二級質譜數據實現多肽自動識別的搜索引擎,功能包括數據精煉、denovo測序、多肽/蛋白質鑒定、翻譯后修飾分析、序列同源性搜索等。Peaks軟件基于獨特的搜索引擎以極低的誤報率增加多肽覆蓋率,顯著提高數據庫檢索過程中多肽識別的準確性和靈敏度[28]。本研究充分利用LTQ-Orbitrap-MS和Peaks Studio的優(yōu)勢,將高分辨質譜與數據庫、生物信息學檢索相結合,實現人參多肽高通量、高可信度的鑒別檢測。

表1 鑒定的人參多肽列表

為表征人參多肽類成分,將人參主根、支根、須根和蘆頭(n=49)各自的混合樣本進行UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析,獲取數據。利用Peaks軟件結合蛋白質檢索數據庫Uniprot人參蛋白質數據庫(Swiss-Prot和TrEMBL),從人參提取物中共鑒定出62個高可信度的多肽序列(見表1)。圖1為人參提取物的總離子流色譜圖。鑒定的人參多肽的保留時間分布于2.26～6.98 min,相對分子質量范圍為599.38至4 991.45 Da。上述多肽中,有19個序列含有翻譯后修飾,其中12個序列含有乙酰化修飾,1個序列含有酰胺化修飾,2個序列含有甲基化修飾,4個序列含有氧化修飾,3個序列含有二硫鍵,并且很多序列含有不止一種翻譯后修飾。

圖1 人參提取物的總離子流色譜圖

表1 (續(xù))

表1 (續(xù))

本研究所鑒定的人參多肽的前體蛋白檢索于兩類人參蛋白質數據庫。第一類是經Swiss-Prot數據庫檢索、經過手工注釋、校驗過的人參蛋白。該類人參多肽大多來源于一系列核糖核酸片段,包括核糖核酸酶1、核糖核酸酶2和核糖核酸酶存儲蛋白。在植物中,許多核糖核酸酶受發(fā)育和環(huán)境因素調控,并在多種生物進程中發(fā)揮重要作用,包括自交不親和性、細胞程序性死亡、對磷饑餓響應、植物防御和發(fā)育。已報道的不同人參屬植物中核糖核酸酶具有抗腫瘤活性和抗HIV-RT活性[29]。核糖核酸酶存儲蛋白是人參的主要蛋白質(ginseng major protein, GMP),相對分子質量為28 kDa。GMP雖然與植物RNA酶高度同源,但卻沒有RNA酶活性[30,31]。GMP的最主要生理功能是作為供氮源蛋白質為人參根的生長提供能量。有研究報道GMP在紅細胞溶血過程中表現出抗補體活性[32]。第二類是經TrEMBL數據庫檢索到的計算機自動注釋、未經人工校驗的人參蛋白。此類人參多肽主要源于人參脫水蛋白,包括脫水蛋白1、脫水蛋白2、脫水蛋白3、脫水蛋白4、脫水蛋白7和脫水蛋白8。脫水蛋白屬于晚期胚胎發(fā)育豐富(LEA)蛋白II家族成員,是普遍存在于高等植物中的干旱誘導蛋白,在種子成熟的脫水耐受過程中發(fā)揮重要作用,在低溫、干旱脅迫下也會大量累積以提高植物適應不良環(huán)境的能力[33]。對人參多肽的深入研究有助于增加人參系統(tǒng)生物學及藥理活性的深刻理解。

2.2 人參主根、支根、須根和蘆頭的PCA和PLS-DA分析

四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用儀具有分析速度快、質量范圍寬、分辨率高等特點,特別是與UPLC結合在復雜樣品高通量的組學分析中具有獨特優(yōu)勢。多變量分析是用于分析和解釋大量組學實驗數據必不可少的有力工具。本研究建立了基于UPLC-QTOF-MS結合多變量分析的高通量多肽組學方法,以揭示人參主根、支根、須根和蘆頭之間的多肽差異。

本研究首先采用無監(jiān)督的PCA法對所有人參樣本進行總體輪廓分布趨勢分析,以觀察不同分組之間的分離程度。PCA結果顯示,所有QC樣本聚類緊密,表明系統(tǒng)穩(wěn)定,方法重復性良好且數據處理過程未引入任何偏差。圖2顯示人參主根與非主根部位顯著分離;支根、須根和蘆頭具有一定的分離趨勢,表明不同形態(tài)區(qū)域的人參根中人參多肽具有區(qū)域性差異,以主根最顯著。

圖2 人參樣本4個不同部位的PCA結果

圖3 人參樣本4個不同部位的PLS-DA分析

有監(jiān)督的PLS-DA使不同組別樣品最大化分離,能夠更好地實現不同類別樣品的聚類分析。本研究利用PLS-DA建立了4個人參根的判別模型,并篩選標志人參多肽。如圖3左側圖所示,PLS-DA模型可以將不同組別分開,表明人參不同部位中多肽組成和/或含量的差異。PLS-DA模型的擬合程度和預測能力通過參數R2Y和Q2Y評價。這兩個參數值越接近1,說明模型的擬合和預測能力越好[34]。本實驗的R2Y為0.838～0.941,Q2Y為0.773～0.926,表明模型具有良好的擬合和預測能力,所建PLS-DA模型可靠。該PLS-DA模型是否過擬合采用置換檢驗法評估。通常,R2Y截距小于0.4且Q2Y截距小于0.05表明模型是有效的。200次置換相應排序檢驗表明(見圖3右側圖),該模型的R2Y和Q2Y截距都在有效范圍內,模型沒有過擬合。

2.3 人參根潛在多肽標志物的發(fā)現與評價

本研究使用PLS-DA模型的變量權重值(VIP)篩選和確定人參潛在多肽標志物。通常認為VIP值大于1的變量對組間分類比較重要[34]。另外,使用單變量分析t-檢驗法評估這些差異多肽的統(tǒng)計顯著性。因此,VIP值大于1,p值小于0.05及倍數變化大于2的已知人參多肽被篩選為人參根潛在多肽標志物。共有25個多肽標志物能夠區(qū)分人參主根、支根、須根和蘆頭(見表2)。具體地,共有包括GP26、GP28、GP29、GP31、GP33、GP34、GP36、GP39、GP42、GP46和GP53的11個潛在多肽標志物在主根中高表達;共有包括GP15、GP48和GP52的3個潛在多肽標志物在支根中高表達;共有包括GP5、GP12和GP23的3個潛在多肽標志物在須根中高表達;共有包括GP18、GP20、GP32、GP41、GP55、GP57、GP59和GP61的8個潛在多肽標志物在蘆頭中高表達。

進一步分析潛在標志物的ROC以評價它們的預測能力。ROC的AUC表示標志物的判別能力,AUC越接近1,表明標志物判別能力越強。具體地,當0.7≤AUC<0.8, 0.8≤AUC<0.9及0.9≤AUC時,分別表示標志物的判別能力合格、良好和優(yōu)秀[34]。如表2所示,本研究篩選得到的生物標志物AUC值為0.77～1.00,且絕大多數大于0.85,表明它們具有很強的判別能力。

表2 人參主根、支根、須根和蘆頭的多肽生物標志物

VIP: variable importance in the projection; FC: the ratio of source group to non-source group;pvalue:t-test adjusted by false discovery rate (FDR); AUC: area under the curve.

3 結論

本研究發(fā)展了基于超高效液相色譜-高分辨質譜的多肽組學方法,應用其對人參主根、側根、須根和蘆頭多肽組進行系統(tǒng)研究,發(fā)現人參4個部位的多肽組具有顯著差異,并篩選出不同部位人參多肽標志物。傳統(tǒng)中醫(yī)認為人參的主根藥效最優(yōu),本研究結果表明主根與其他部位多肽成分差別最大,為人參藥效研究提供了除人參皂苷外的化學基礎研究的新思路。