韓潤川, 班艷娜, 甄乾娜, 周 瑩, 張曉清, 丁 敏*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院, 臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室, 重慶 400016; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖健康與不孕癥?？? 重慶 400016; 3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科, 重慶 400016)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是常見于育齡期女性的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,發(fā)病率在育齡期婦女中高達(dá)10%[1]。PCOS患者易發(fā)生糖代謝紊亂,患2型糖尿病的風(fēng)險是健康人的5～10倍。30%～35%的PCOS患者會出現(xiàn)糖耐量受損,65%～70%的患者伴發(fā)胰島素抵抗[2,3]。而機(jī)體糖代謝紊亂,尤其是胰島素水平升高,會促進(jìn)血液中雄激素水平升高,使PCOS患者發(fā)生卵巢功能障礙[4,5]。目前,PCOS的診斷主要依據(jù)稀發(fā)排卵或無排卵、高雄激素血癥及卵巢多囊性改變。但高雄激素血癥并不是確診PCOS的必備條件,有15%～20%的PCOS患者未見雄激素升高,并且在確診PCOS時,還需排除非典型性腎上腺皮質(zhì)增生、柯興綜合征、分泌雄激素的卵巢腫瘤等引起雄激素升高的疾病[6]。因此,需要尋找PCOS新的實(shí)驗室診斷標(biāo)志物。

吲哚丙酸(indolyl-3-propionic acid, IPA)、吲哚乙酸(indolyl-3-acetic acid, IAA)、吲哚(indole, IND)與3-甲基吲哚(3-methylindole, 3-MI)是色氨酸在腸道菌群作用下的代謝產(chǎn)物,即細(xì)菌代謝物[7,8]。吲哚類物質(zhì),作為腸道菌群和人體細(xì)胞間重要的信號分子[9],通過體內(nèi)的氧化應(yīng)激,腸道炎癥反應(yīng)和激素分泌等途徑參與人體生理功能調(diào)節(jié)[10]。IND可刺激腸道細(xì)胞調(diào)節(jié)胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide 1, GLP-1)的釋放[11], GLP-1是一種葡萄糖濃度依賴的具有降糖作用的腸源性激素,可以提高機(jī)體對葡萄糖的敏感性[12]。IPA是IND的細(xì)菌代謝產(chǎn)物,可以保護(hù)胰島細(xì)胞,促進(jìn)胰島素的釋放,被認(rèn)為是2型糖尿病的保護(hù)性因子[13]。吲哚類物質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)體的糖代謝功能,而糖代謝紊亂是PCOS的特征性癥狀及發(fā)病誘因[14]。但目前尚無研究報道吲哚類物質(zhì)在PCOS中的作用。因此,檢測PCOS患者血漿中吲哚類物質(zhì),不僅有助于闡明腸道菌群與PCOS的關(guān)系,也為尋找PCOS新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供方向。

目前,血漿吲哚類物質(zhì)的檢測方法主要采用高效液相色譜-熒光法和超高效液相色譜-質(zhì)譜法[15,16]。同時檢測人血漿中IPA、IAA、IND和3-MI等吲哚類物質(zhì)的方法尚未見報道。本研究建立一種快速、靈敏的高效液相色譜-熒光法用于人血漿吲哚類物質(zhì)(IAA、IPA、IND和3-MI)的同時檢測,并采用所建方法測定PCOS患者與健康育齡期女性血漿中吲哚類物質(zhì),以闡明其在PCOS患者中的變化,并探究吲哚類物質(zhì)在PCOS中的潛在診斷價值。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1100 LC型高效液相色譜儀(配有G123型熒光檢測器); Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm, 4.6 μm); Milli-Q超純水過濾裝置(美國Millipore公司); HIMAC-15低溫臺式離心機(jī)、SAVANT ISS110真空離心濃縮儀(美國Thermo公司); SB-3200超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司); ZWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造公司); GM-0.33隔膜真空泵(天津津騰有限公司)。

IPA、IAA、IND和3-MI標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%,美國Sigma公司);甲奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%,北京百靈威科技有限公司);甲醇(色譜純,美國Tedia公司)。

分別稱取一定量的IPA、IAA、IND、3-MI和甲奈酚標(biāo)準(zhǔn)品,用流動相(15 mmol/L磷酸二氫鈉溶液-甲醇(42∶58, v/v)分別配制IAA(0.2 mol/L)、IPA(0.1 mol/L)、IND(0.1 mol/L)、3-MI(0.1 mol/L)和甲萘酚(5.0 g/L)標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分裝保存于-20 ℃。使用前用流動相稀釋至所需濃度。

1.2 實(shí)驗條件

1.2.1樣本采集及預(yù)處理

患者61例,均經(jīng)過病史詢問、性激素測定與超聲檢查,確診為PCOS患者。同時選擇健康育齡期女性25例作為對照組,兩組樣本均來自重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。本研究獲得重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)和受試者的知情同意。抽取受檢者空腹靜脈血2 mL,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,低速離心后取血漿于-20 ℃保存。

取血漿300 μL,加入10 μL 5 mg/L甲萘酚溶液(內(nèi)標(biāo))和600 μL乙醚,渦旋混勻后,在搖速為250 r/min的搖床作用下振蕩18 min,于4 ℃以13 300 g離心5 min,取上清液,真空離心旋干后,加入90 μL 15 mmol/L磷酸二氫鈉溶液-甲醇(42∶58, v/v)復(fù)溶,渦旋5 min,取上清液50 μL進(jìn)樣分析。

1.2.2HPLC條件

色譜柱:Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm, 4.6 μm);柱溫:30 ℃;流動相:15 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 4.6)-甲醇(42∶58, v/v);流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:50 μL。熒光檢測波長程序設(shè)置:0～6.00 min,激發(fā)波長(λex)和發(fā)射波長(λem)分別為282 nm和352 nm; 6.01～9.00 min,λex和λem分別為274 nm和340 nm; 9.01～14.00 min,λex和λem分別為282 nm和352 nm。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

本實(shí)驗的待測物IAA、IPA、IND和3-MI以及選取的內(nèi)標(biāo)都具有自然熒光,為了提高方法的靈敏度,通過Agilent 1100 LC色譜工作站分別對各待測物進(jìn)行熒光光譜掃描,根據(jù)各待測物最佳檢測波長,設(shè)置程序化熒光檢測波長。

2.2 樣本預(yù)處理方法的確定

為了減少基質(zhì)干擾對色譜分析的影響,本實(shí)驗分別考察了蛋白質(zhì)沉淀和液-液萃取法兩種預(yù)處理方法(見圖1)。與甲醇蛋白質(zhì)沉淀法比較,采用乙醚進(jìn)行液-液萃取血漿樣本,內(nèi)源性物質(zhì)干擾較小。因此,本實(shí)驗選擇乙醚進(jìn)行液-液萃取,以實(shí)現(xiàn)對血漿中的目標(biāo)化合物的凈化與富集。

圖1 血漿經(jīng)不同方法預(yù)處理后的色譜圖

2.3 色譜條件的確定與優(yōu)化

本實(shí)驗選擇甲醇和磷酸鹽緩沖溶液作為流動相,對流動相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)、緩沖液pH值及柱溫進(jìn)行了考察。

以血漿為樣本進(jìn)行分析,甲醇體積分?jǐn)?shù)為55%～60%時,隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大,各分析物的保留時間縮短,分離度(R)逐漸減小,而甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%時,內(nèi)標(biāo)與內(nèi)源性物質(zhì)的分離度小于2.0;而甲醇體積分?jǐn)?shù)為55%時,保留時間較長。故選擇流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為58%。

通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)15 mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液的pH值，考察其對分離效果的影響(見圖2)。pH值為3.8時,IPA與IND不能有效分離(R<2.0); pH值為5.4與6.5時,IPA與IAA不能有效分離(R<1.5);而pH值為4.6時,各組分均能實(shí)現(xiàn)有效分離。故流動相中磷酸鹽緩沖液的pH值選擇為4.6。

考察了柱溫對分析效果的影響。當(dāng)柱溫為25 ℃時,保留時間較長;柱溫為35 ℃時,3-MI的分離度減小;而柱溫為30 ℃時,能在較短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)各組分的有效分離。因此,實(shí)驗將柱溫設(shè)置為30 ℃。

圖2 不同pH值條件下血漿樣本的色譜圖

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

配制IAA、IPA、IND和3-MI系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)至健康人混合血漿樣本中,經(jīng)過樣本預(yù)處理后檢測。以血漿加入待測物的濃度為橫坐標(biāo),血漿中待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值減去空白血漿中待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;以信噪比(S/N)=3計算檢出限,結(jié)果見表1。

表1 血漿中IAA、IPA、IND和3-MI的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍和檢出限

y: ratio of peak-area of the analytes to IS subtract the ratio of peak area of pooled plasma to IS;x: concentration of the analytes, nmol/L.

選取健康人血漿(低濃度組)和PCOS患者血漿(高濃度組),日內(nèi)重復(fù)測定5次,連續(xù)測定5 d,以進(jìn)行日內(nèi)與日間精密度考察,結(jié)果見表2。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤6.31%,表明該方法精密度良好。

2.4.2回收率

分別添加高、中、低3種濃度的15 μL IAA、IPA、IND和3-MI混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至285 μL健康人混合血漿樣本中,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,結(jié)果見表3。IAA、IPA、IND和3-MI的平均回收率為97.5%～107.0%,表明方法準(zhǔn)確可靠。

表2 血漿吲哚類物質(zhì)的精密度(n=5)

表3 血漿中吲哚類物質(zhì)的加標(biāo)回收率(n=3)

2.4.3干擾試驗

溶血、脂血、黃疸是血漿樣本臨床檢測中常見的干擾因素[17]。溶血標(biāo)本會將細(xì)胞內(nèi)容物混入血漿,從而影響血漿樣本的檢測[18],而黃疸與乳糜顆粒會干擾檢測器的光譜分析,影響檢測結(jié)果[19]。因此需要明確干擾物質(zhì)濃度對檢測結(jié)果的影響。

按照美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)。用甲醇將膽紅素、膽固醇及甘油三酯凍干粉標(biāo)準(zhǔn)品溶解,配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。取健康人混合血漿285 μL,加入15 μL不同濃度的膽紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)樣本預(yù)處理后檢測。分別測定加入膽紅素前的血漿待測物濃度(XC)和加入后的待測物濃度(XT),若干擾值(XT-XC)在95%置信區(qū)間內(nèi),則說明膽紅素對檢測結(jié)果無顯著干擾。結(jié)果表明,血漿膽紅素濃度≤36.5 μmol/L時對測定結(jié)果無影響。采用同樣的方法考察血漿中甘油三酯和膽固醇對檢測方法的干擾,結(jié)果顯示,甘油三酯濃度≥2.9 mmol/L、總膽固醇濃度≥16.6 mmol/L時,對檢測有影響。因此在檢測實(shí)際樣本時,出現(xiàn)黃疸和脂血現(xiàn)象可能會影響檢測結(jié)果。

取健康人EDTA抗凝全血分成兩份,一份在4 ℃、2 000 g離心力下離心,分離血漿;另一份在-20 ℃與室溫間反復(fù)凍融直至全部溶血,均用生理鹽水配制不同程度的溶血標(biāo)本。一部分樣本用于血紅蛋白的檢測,另一部分樣本經(jīng)預(yù)處理后檢測。結(jié)果顯示,溶血標(biāo)本血紅蛋白含量≤35 g/L時對測定無影響,故在檢測實(shí)際樣本時應(yīng)避免溶血。

2.4.4穩(wěn)定性考察

將血漿樣本于-20 ℃凍存0、5、10和30 d,在常溫下解凍,經(jīng)樣本預(yù)處理后測定,計算各待測物的濃度,以及濃度的RSD。結(jié)果表明,各待測物RSD均小于日間RSD,表明血漿樣本在-20 ℃下至少可保存30 d。

2.5 臨床應(yīng)用

2.5.1吲哚類物質(zhì)含量的測定

用所建立的方法分別測定正常對照組(n=25)與PCOS患者組(n=61)血漿吲哚類物質(zhì)濃度,結(jié)果見表4。結(jié)果顯示:與對照組比較,PCOS患者血漿的IAA、IPA、IND和3-MI明顯升高,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 PCOS組和對照組血漿中IAA、IPA、IND和3-MI的濃度

P: the statistical significance was assessed using Student’st-test.

2.5.2血漿吲哚類物質(zhì)診斷PCOS

本實(shí)驗用ROC曲線分別評價血漿吲哚類物質(zhì)對PCOS的診斷效能并尋找最優(yōu)診斷閾值, ROC曲線圖見圖3。其中,IND的診斷效能最好,ROC曲線下面積(AUC)為0.900,靈敏度和特異度分別為82.0%和88.0%。結(jié)果表明,IND對PCOS具有良好的診斷價值。

圖3 血漿吲哚類物質(zhì)診斷PCOS的ROC曲線

2.5.3PCOS危險因素分析

對PCOS組和對照組中4種吲哚類物質(zhì)進(jìn)行Logistic回歸分析,優(yōu)勢比(odds ratio, OR)是反映吲哚類物質(zhì)與PCOS關(guān)系的指標(biāo)。當(dāng)OR>1時,表示其與疾病發(fā)生呈正相關(guān)。結(jié)果顯示,IND是PCOS發(fā)生的危險因素(OR=1.228, 95%置信區(qū)間:1.125～1.341,P<0.001)。

3 結(jié)論

本研究建立了同時檢測血漿中的IAA、IPA、IND和3-MI吲哚類物質(zhì)的高效液相色譜-熒光法。本方法采用等度洗脫,分析時間短,靈敏度高,樣本用量少,適用于臨床與科研。該方法成功應(yīng)用于分析PCOS患者和正常育齡期女性體內(nèi)吲哚類物質(zhì)的濃度。