金利群，金偉熔，柳志強(qiáng)*

1(浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014) 2(生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014) 3(手性生物制造國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014)

甲硫氨酸(methionine, Met, (S)-2-Amino-4-(methylthio)butanoic acid)[1-2]是必需氨基酸中唯一含硫元素的氨基酸，分為L(zhǎng)型和D型2種同分異構(gòu)體，在自然界中主要以L型為主。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中甲硫氨酸被視為是家禽[1]的第一限制性氨基酸。

生物合成途徑中細(xì)胞代謝通量的平衡依賴于關(guān)鍵代謝物、酶和調(diào)節(jié)因子的協(xié)調(diào)[14-15]。目標(biāo)產(chǎn)物的合成總是由多種酶協(xié)同催化完成，代謝工程的發(fā)展需要通過(guò)理性設(shè)計(jì)代謝途徑進(jìn)一步完善目標(biāo)產(chǎn)物形成[16-18]。啟動(dòng)子工程提供了具有不同強(qiáng)度和功能的各種啟動(dòng)子，并且已被公認(rèn)為精確控制代謝工程中基因表達(dá)的有效工具[18]。

已有研究報(bào)道通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Na2S2O3，顯著提高了L-甲硫氨酸的產(chǎn)量[19]，這為通過(guò)硫模塊優(yōu)化提高L-甲硫氨酸的生物合成提供了重要的思路。本文以實(shí)驗(yàn)室前期工作中構(gòu)建的重組菌E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H為出發(fā)菌株，通過(guò)基因表達(dá)，確定了硫代謝模塊中的關(guān)鍵酶；在此基礎(chǔ)上，研究了強(qiáng)啟動(dòng)子介入和關(guān)鍵基因共表達(dá)對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；并進(jìn)一步優(yōu)化了培養(yǎng)基主要組分的濃度，為提高L-甲硫氨酸的生物合成提供了良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本文中所使用的菌株及相關(guān)基因型見(jiàn)表1，質(zhì)粒說(shuō)明見(jiàn)表2。

表1 主要菌株與說(shuō)明Table 1 Main strains and relevant instructions

表2 主要質(zhì)粒與說(shuō)明Table 2 Main plasmids and relevant instructions

1.1.2 主要工具酶、試劑和試劑盒

限制性內(nèi)切酶EcoRI FastDigest、NcoI FastDigest、BamHI FastDigest、XbaI FastDigest、KpnI FastDigest、SalI FastDigest、PstI FastDigest和BcuI FastDigest，以及RNA提取試劑盒PureLinkTMRNA Mini Kit，Thermo Fisher Scientific公司；PCR擴(kuò)增酶Pfu酶、Taq酶，博彩生物公司；ClonExpressTMOneStep Cloning Kit連接試劑盒、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒，諾維贊公司；基因組提取試劑盒FastDNA?Spin Kit for Soil，MPbio；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Axygen生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

Biometra PCR儀，Biometra公司；Sorvall Lynx 4000高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scinentific公司；Mini-Protean Ⅱ型電泳儀、GelDoc凝膠成像儀，Bio-Rad公司；5417R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、熒光定量PCR儀22331 Hamburg，德國(guó)Eppendorf公司；MS-100恒溫金屬振蕩反應(yīng)器，杭州奧盛儀器有限公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，美國(guó)Thermo公司；UltiMate3000高效液相色譜，美國(guó)戴安公司；電穿孔儀MicroPulserTM，上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建含有甲硫氨酸硫代謝通路中關(guān)鍵基因glpE、grx1、cysK、cysM或nrdH的雙表達(dá)質(zhì)粒

用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒提取E.coliW3110菌株的基因組DNA，以該基因組為模版，通過(guò)PCR獲得目的基因序列。然后通過(guò)對(duì)表達(dá)載體pTrc99A使用限制性內(nèi)切酶雙酶切以線性化，膠回收純化回收目的片段。采用諾維贊ClonExpressTMOneStep Cloning Kit試劑盒連接線性化載體和目的基因片段。涂布至LB平板(100 μg/mL Amp)上篩選，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，獲得以pTrc99A質(zhì)粒為載體的重組質(zhì)粒pTrc-grx1、pTrc-glpE、pTrc-cysM、pTrc-cysK和pTrc-nrdH。

提取上述質(zhì)粒作為模板，通過(guò)PCR克隆得到序列trc至與其對(duì)應(yīng)的終止子序列。提取E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H的質(zhì)粒pA*H，同時(shí)通過(guò)PCR線性化pA*H質(zhì)粒的trc啟動(dòng)子上游。借助諾維贊ClonExpressTMOne Step Cloning Kit試劑盒將trc啟動(dòng)子表達(dá)的目的基因插入到質(zhì)粒pA*H上游，得到pA*H-trc-grx1、pA*H-trc-glpE、pA*H-trc-cysK和pA*H-trc-nrdH4個(gè)重組質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證后送公司測(cè)序。

共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)在以上構(gòu)建的pTrc-target gene上采用酶切連接的方法繼續(xù)插入基因，得到pTrc-nrdH-glpE的共表達(dá)質(zhì)粒，克隆目標(biāo)序列片段，重復(fù)上述方法可以構(gòu)建得到pA*H-trc-nrdH-glpE質(zhì)粒。

1.2.2 CRISPR-Cas9基因組改造[20]獲得E.coliW3110 JAHFEBL/trc-cysK

以E.coliW3110 JAHFEBL/trc-cysK的構(gòu)建為例。使用基因組提取試劑盒提取E.coliW3110基因組。以提取到的基因組為模版擴(kuò)增獲得donor DNA上游同源臂片段和下游同源臂片段，通過(guò)融合PCR獲得donor DNA。將donor DNA片段連接至T載體，獲得T-donor DNA質(zhì)粒，以之為模板，使用同源臂PCR體系擴(kuò)增donor DNA片段，通過(guò)Clean Up試劑盒將質(zhì)量濃度濃縮至900 ng/L以上。

PCR突變pTarget質(zhì)粒并用BcuI FastDigest和DpnI酶切，T4連接酶16 ℃過(guò)夜自連，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒并送測(cè)序。

將donor DNA片段和pTarget -cysK質(zhì)粒各0.5 μL通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到含有pCas質(zhì)粒的E.coliW3110 JAHFEBL電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，涂布SD(50 μg/mL)和kan(50 μg/mL)雙抗性平板30 ℃培養(yǎng)篩選，PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。消除pCas和pTarget質(zhì)粒，獲得E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK菌株。

1.2.3 啟動(dòng)子文庫(kù)構(gòu)建

以pLVX-AcGFP1-N1載體為模板，PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白目的基因AcGFP1。通過(guò)限制性內(nèi)切酶Thermo ScientificTMFastDigestEcoRI和HindIII對(duì)質(zhì)粒pTrc99A進(jìn)行酶切。將目的基因PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物使用AXYGEN AxyPrepTM PCR Cleanup Kit試劑盒純化后，再利用諾維贊ClonExpressTMOneStep Cloning Kit試劑盒連接兩者，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrc99A-AcGFP1。經(jīng)DNA測(cè)序鑒定得到正確的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。

以重組質(zhì)粒pTrc99A-AcGFP1為模板，分2次PCR突變質(zhì)粒中trc啟動(dòng)子的-35到-1區(qū)域，擴(kuò)增得到含有PG3啟動(dòng)子重組質(zhì)粒pPG3-AcGFP1。經(jīng)DNA測(cè)序鑒定得到正確的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。

設(shè)計(jì)重組質(zhì)粒pPG3-AcGFP1的單點(diǎn)突變引物對(duì)質(zhì)粒pPG3-AcGFP1上的PG3啟動(dòng)子的-35 box到+1 box逐個(gè)堿基進(jìn)行單點(diǎn)突變，每個(gè)位點(diǎn)分別突變?yōu)镹(A/T/C/G)，依序?qū)⒚?個(gè)PCR產(chǎn)物純化并濃縮至同一個(gè)PCR管中，轉(zhuǎn)化到E.coliW3110感受態(tài)菌株中，涂布到含有100 μg/L Amp的LB平板中，37 ℃培養(yǎng)后，獲得轉(zhuǎn)化單菌落。將單菌落接種96孔板(每個(gè)孔800 μL含有0.1 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基)中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后，將200 μL菌液轉(zhuǎn)接到另一個(gè)96孔板(每個(gè)孔中800 μL含有0.1 μg/mL Amp和0.024 μg/mL IPTG的LB培養(yǎng)基)中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。

結(jié)束培養(yǎng)后于4 000×g，4 ℃離心10 min，去掉上清液，用pH 7.0的PBS磷酸緩沖溶液洗滌菌體2次后,加入1 mL PBS磷酸緩沖液(50 mmol/L)重懸菌體。取菌體溶液200 μL分別在波長(zhǎng)為600 nm的條件下測(cè)量吸光度。然后取重懸的菌體溶液200 μL用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm條件下測(cè)量其相對(duì)熒光值，即RFU值。如果測(cè)量的RFU值和OD600超出儀器檢測(cè)線性范圍，則用RBS溶液稀釋一定倍數(shù)后再次測(cè)量。最后根據(jù)RFU/OD600的比值來(lái)衡量啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。

1.2.4 p32啟動(dòng)子替換質(zhì)粒構(gòu)建

以pA*H-p32-nrdH-glpE質(zhì)粒的構(gòu)建為例。提取pTrc-nrdH-glpE質(zhì)粒，PCR對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行突變，獲得質(zhì)粒p32-nrdH-glpE，轉(zhuǎn)入到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增質(zhì)粒，菌落PCR檢測(cè)并測(cè)序。然后利用1.2.1的質(zhì)粒構(gòu)建方法獲得質(zhì)粒pA*H-p32-nrdH-glpE。

1.2.5 菌株培養(yǎng)方法

用接種環(huán)從LB固體平皿培養(yǎng)基(2%瓊脂，100 μg/mL Amp)中挑選單菌落轉(zhuǎn)接至含LB培養(yǎng)基(100 μg/mL Amp)的試管中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h。將上述培養(yǎng)好的種子液，以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)2 h。加入4 μL IPTG母液(0.12 g/mL)后28 ℃，180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO416 g/L，KH2PO41 g/L，Na2S2O31 g/L，酵母提取物2 g/L，金屬離子1 mL/L。500 mL搖瓶培養(yǎng)基裝液量為20 mL。其中金屬離子為MgSO4·H2O 500 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，MnSO4·8H2O 5 mg/L，ZnSO45 mg/L溶于超純水。115 ℃高溫蒸汽滅菌30 min。在接種時(shí)加入VB12母液(20 μg/mL)、賴氨酸(10 mg/L)、Amp(100 μg/mL)，以及分裝滅菌的CaCO3固體0.20 g。

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化

利用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察了不同葡萄糖添加量(20～60 g/L)，硫代硫酸鈉添加量(0.5～5.0 g/L)、氮源添加量(1.0～3.5 g/L)、(NH4)2SO4濃度(8～28 g/L)和KH2PO4添加量(0.5～3.0 g/L)對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響。

1.2.7 分析方法

1.2.7.1L-甲硫氨酸的HPLC檢測(cè)

取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP中，12 000×g離心2 min，保存上清；將100 μL上清液稀釋至1.5 mL EP管中，加入100 μL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液和100 μL體積分?jǐn)?shù)1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液，60 ℃避光反應(yīng)60 min；再用0.22 μm有機(jī)膜進(jìn)行過(guò)濾，用以高效液相色譜檢測(cè)。

L-甲硫氨酸檢測(cè)條件：分析柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=1∶1：其中，水相由1.5 mL乙酸和2.05 g乙酸鈉溶于1 L超純水，調(diào)pH值至3.5；柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，紫外波長(zhǎng)365 nm，時(shí)間16 min。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備：采用外標(biāo)法定量，分別配制質(zhì)量濃度0.5～2.5 g/L的L-甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC分析檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積X為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度Y(g/L)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得回歸方程。

1.2.7.2 熒光定量PCR檢測(cè)

在發(fā)酵培養(yǎng)12 h時(shí)取樣，取1mL發(fā)酵液于1.5 mL EP中，12 000×g離心2 min，分離上清液。在1.5 mL離心管沉淀中加入1 mL蒸餾水洗滌后，再加入1 mL體積分?jǐn)?shù)20%乙酸溶液混勻，充分中和沉淀中的CaCO3。使用PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒提取并純化RNA。提取的總RNA按照500 ng使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以E.colik-12 MG1655的16S rRNA作為對(duì)照基因。每組設(shè)置3個(gè)平行，將cDNA樣品作為模板上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 trc啟動(dòng)子替換菌株構(gòu)建

2.1.1trc啟動(dòng)子提高grx1、glpE、cysK、nrdH和cysM表達(dá)對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響

從基因組上克隆得到目的基因grx1、glpE、cysK、nrdH和cysM，通過(guò)在質(zhì)粒pA*H上插入包括trc啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄元件，過(guò)表達(dá)grx1、glpE、cysK、nrdH和cysM基因，獲得E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-grx1、E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-glpE、E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-cysK、E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-nrdH和E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-cysM菌株(如圖1)，檢測(cè)這些重組菌株的甲硫氨酸產(chǎn)量以探究關(guān)鍵基因。如圖2所示，作為非cysM依賴通路，glpE能轉(zhuǎn)化硫代硫酸鹽生成亞硫酸鹽[8]，過(guò)表達(dá)glpE使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高了約15.3%。過(guò)表達(dá)cysK能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高約12.6%。由于nrdH在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)可以將S-磺酸半胱氨酸(SSC)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半胱氨酸和亞硫酸鹽，表達(dá)攜帶nrdH的質(zhì)?？梢蕴岣週-半胱氨酸的代謝水平[7]，過(guò)表達(dá)nrdH也能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量有近8%的提升。

通過(guò)分析重組菌生長(zhǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒上表達(dá)單一基因?qū)w的生長(zhǎng)狀況影響并不顯著(圖3)?？梢?jiàn)，cysM、cysK、glpE、nrdH和grx1并非通過(guò)增加菌體量提升L-甲硫氨酸的合成水平。

2.1.2 共表達(dá)基因glpE、nrdH和cysK對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響

根據(jù)上述結(jié)果將glpE、nrdH在E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK菌株中共表達(dá)。使用CRISPR-Cas9技術(shù)在基因組上用trc啟動(dòng)子替換cysK的啟動(dòng)子獲得E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK菌株，L-甲硫氨酸的產(chǎn)量提升約11.3%；在此基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)glpE基因獲得E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-glpE菌株，其產(chǎn)量相較對(duì)照組提升了約23.4%；而E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量相較對(duì)照組提升了16.8%。同時(shí)在質(zhì)粒pA*H上共表達(dá)glpE和nrdH基因，E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH-glpE菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量相較對(duì)照組提升了28.2%(圖4)。L-甲硫氨酸的產(chǎn)量提升并非由菌體量增加引起(圖5)。

圖1 雙表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of the double expression recombinant plasmids

圖2 質(zhì)粒上分別過(guò)表達(dá)基因grx1, glpE, cysK,nrdH和cysM對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Influence of grx1, glpE, cysK, nrdH and cysM overexpressions in plasmids to the titer of L-methionine注：相比對(duì)照組，P值<0.01表示實(shí)驗(yàn)組差異非常顯著(***)，P值處于0.01～0.05之間表示實(shí)驗(yàn)組差異顯著(**)，P值處于0.05～0.16之間表示實(shí)驗(yàn)組差異輕微顯著(*)。下同。

圖3 質(zhì)粒上分別過(guò)表達(dá)基因grx1, glpE, cysK,nrdH和cysM對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.3 Influence of grx1, glpE, cysK, nrdH and cysM overexpressions in plasmids to the growth of the strains

圖4 多基因共表達(dá)對(duì)L-甲硫氨酸的影響Fig.4 Influence of multigene coexpression to the titer of L-methionine

圖5 多個(gè)目的基因共表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.5 Influence of the multigene co-expression to the growth of strains

2.2 高強(qiáng)度PG3突變啟動(dòng)子的獲得

2.2.1 啟動(dòng)子文庫(kù)構(gòu)建

為了獲得更高強(qiáng)度的啟動(dòng)子以優(yōu)化2.1中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，選擇PG3[21]為模板構(gòu)建啟動(dòng)子文庫(kù)，序列為TTGACATTGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATT,該啟動(dòng)子由原始啟動(dòng)子雜合而成，具有良好的轉(zhuǎn)錄活性和較高的突變潛力。通過(guò)分析單點(diǎn)突變對(duì)啟動(dòng)子影響，組合突變位點(diǎn)，最終獲得包含32個(gè)樣本的突變啟動(dòng)子文庫(kù)。如圖6所示，其RFU/OD600比值跨度從最低的256.3到最高的8 351.2，跨度適中，滿足了下游基因?qū)Σ煌瑥?qiáng)度調(diào)控的需求。其與PG3啟動(dòng)子相比，強(qiáng)度變化范圍為11.8%～385.3%。

圖6 PG3突變啟動(dòng)子文庫(kù)Fig.6 PG3 mutation prompter library注：從左到右按pG3,p1,p2…p31,p32排列。

2.2.2 熒光定量PCR比較trc和p32啟動(dòng)子強(qiáng)度

分別采用發(fā)酵培養(yǎng)基模擬發(fā)酵條件，培養(yǎng)攜帶p32-AcGFP和pTrc-AcGFP質(zhì)粒的E.colik-12 W3110菌株。取發(fā)酵12 h的菌液使用熒光定量PCR檢測(cè)突變啟動(dòng)子p32相對(duì)trc啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。p32啟動(dòng)子核心區(qū)域序列為TTGACAGAGGCAGGG CGACATTTTATAATAAGACTT。

本文比較了AcGFP在p32和trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的轉(zhuǎn)錄水平差異(表3)，相比于trc啟動(dòng)子，突變文庫(kù)中熒光強(qiáng)度最高的突變啟動(dòng)子p32的轉(zhuǎn)錄水平提高了約150%，這可以進(jìn)一步上調(diào)E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH-glpE菌株硫同化模塊關(guān)鍵酶的表達(dá)，在目標(biāo)宿主菌株中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

表3 啟動(dòng)子p32和trc對(duì)AcGFP轉(zhuǎn)錄水平的影響Table 3 Effect of promoter p32 and trc on the transcription levels of AcGFP

2.3 p32啟動(dòng)子替換

2.3.1 基因glpE和cysK不同啟動(dòng)子對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響

由于提高glpE和cysK的表達(dá)能有效提高菌體L-甲硫氨酸的產(chǎn)量，考慮通過(guò)提高基因組上glpE的表達(dá)量以減少質(zhì)粒上串聯(lián)表達(dá)的基因數(shù)。通過(guò)分別優(yōu)化cysK和glpE基因的表達(dá)效果，比較兩者差異，選擇較優(yōu)菌株。

如圖7所示，在基因組水平用p32啟動(dòng)子替換glpE原始啟動(dòng)子能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高15.4%，而在質(zhì)粒上用p32啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)glpE的菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量則提高了21.2%，因此選擇在質(zhì)粒上使用p32過(guò)表達(dá)glpE。用p32啟動(dòng)子替換cysK原始啟動(dòng)子能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高15.2%，而用trc啟動(dòng)子替換cysK原始啟動(dòng)子則使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高了24.2%，因此在基因組上使用p32替換cysK啟動(dòng)子提高其表達(dá)量。

圖7 基因glpE和cysK對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量最優(yōu)表達(dá)Fig.7 Optimization of glpE and cysK expressions to L-methionine

2.3.2 p32在菌株中的應(yīng)用

使用p32啟動(dòng)子替換pA*H-trc-nrdH-glpE和pA*H-trc-nrdH-grx1-glpE質(zhì)粒中trc啟動(dòng)子，獲得pA*H-p32-nrdH-glpE和pA*H-p32-nrdH-grx1-glpE質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入到E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK菌株中比較L-甲硫氨酸的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.3 g/L，相較原始菌株提高了41.5%，相較E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH-glpE菌株提高了12.0%。

圖8 p32啟動(dòng)子應(yīng)用對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Influence of applying p32 promoter to the titer of L-methionine

2.4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

培養(yǎng)基組分優(yōu)化結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，40 g/L的葡萄糖添加量可以使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高13.8%，但繼續(xù)提高葡萄糖的添加量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果L-甲硫氨酸產(chǎn)量，反而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖添加量在30 g/L和40 g/L之間時(shí)，L-甲硫氨酸產(chǎn)量存在上升空間。通過(guò)細(xì)化葡萄糖添加量的濃度梯度，可知，在添加34 g/L葡萄糖時(shí)L-甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)到最高，提升約18.6%(如圖9-B)。

考慮到重組菌株的改造集中在硫代硫酸鹽利用途徑中，提高硫代硫酸鹽的供給對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的提升應(yīng)該有較為重要的意義[19]。因此，在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上考察了硫代硫酸鈉的添加量對(duì)菌株發(fā)酵的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9-C所示，硫代硫酸鈉的添加量增加至3 g/L時(shí)，L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高了41.3%，而繼續(xù)提高硫代硫酸鈉的供給并不能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量進(jìn)一步提升。降低硫代硫酸鈉的濃度(0.5 g/L)使L-甲硫氨酸產(chǎn)量急劇下降，為對(duì)照組的48.8%。硫代硫酸鈉的添加對(duì)菌體生物量沒(méi)有造成影響，整體相差并不明顯。

進(jìn)一步考察了氮源添加量對(duì)菌體發(fā)酵的影響。如圖9-D所示，當(dāng)酵母提取物添加量為2.0 g/L時(shí)，菌體生物量和L-甲硫氨酸產(chǎn)量最優(yōu)。如圖9-E所示，培養(yǎng)基中提高硫酸銨的濃度對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量和菌體生物量并沒(méi)有明顯促進(jìn)作用，相反，過(guò)高的銨鹽濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[22]。

如圖9-F所示，當(dāng)KH2PO4添加量提高至2.0 g/L時(shí)，重組菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高了約9.7%；在此基礎(chǔ)上繼續(xù)提高KH2PO4濃度對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量并沒(méi)有顯著的影響。

A-葡萄糖添加濃度(20～60 g/L)對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；B-葡萄糖添加濃度(32～40 g/L)對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；C-硫代硫酸鈉添加濃度對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；D-酵母提取物添加濃度對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；E-(NH4)2SO4添加濃度對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；F-KH2PO4添加濃度對(duì)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響圖9 培養(yǎng)基優(yōu)化Fig.9 Optimzation of fermentation media

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方進(jìn)一步發(fā)酵驗(yàn)證表明，E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE菌株的產(chǎn)量可達(dá)到2.3 g/L，相比優(yōu)化前的發(fā)酵結(jié)果(1.3 g/L)提升了約77.0%。

3 結(jié)論

本文以pA*H質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建了trc啟動(dòng)子雙表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)提高cysK、glpE和nrdH的表達(dá)水平能改善L-甲硫氨酸的產(chǎn)量。以E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H為基礎(chǔ)，在基因組上用trc啟動(dòng)子替換了cysK的本地啟動(dòng)子，在質(zhì)粒pA*H上插入glpE和nrdH基因共表達(dá)，構(gòu)建了E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH-glpE，發(fā)酵48 h的L-甲硫氨酸產(chǎn)量提升28.2%。以PG3啟動(dòng)子為模板建立了包含32個(gè)樣本的啟動(dòng)子文庫(kù)，強(qiáng)度范圍為11.8%～385.3%。應(yīng)用p32突變啟動(dòng)子使重組菌株trc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE的L-甲硫氨酸產(chǎn)量相比trc-cysK/pA*H-nrdH-glpE菌株提升了約12.0%。在此基礎(chǔ)上，硫代硫酸鈉添加量的提升有效彌補(bǔ)了硫通路代謝酶對(duì)催化底物的需求，重組菌株E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE發(fā)酵48 h生產(chǎn)的L-甲硫氨酸產(chǎn)量提升了約77.0%。本文通過(guò)對(duì)硫代謝模塊的優(yōu)化提高了L-甲硫氨酸的產(chǎn)量，同時(shí)為其他含硫氨基酸的生物合成提供了研究思路。