王婷，馬洪坤，趙桂紅，蔡檸勻，張德志，陳寧,2,3，4*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津，300457) 3(教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津，300457) 4(天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津，300457)

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種重要的工業(yè)微生物[1-2]。為了獲得優(yōu)良的工程菌株，提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量，常在代謝工程改造過程中對關(guān)鍵基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。然而，C.glutamicum遺傳操作工具十分匱乏，導(dǎo)致篩選突變菌株困難重重。傳統(tǒng)策略采用的是隨機(jī)誘變的方法[3]。目前，C.glutamicumATCC 13032的基因組編輯主要依賴pk18mobsacB反選擇系統(tǒng)[4]，使用該系統(tǒng)對基因組進(jìn)行定點(diǎn)突變時，通常采用的是先敲除再整合的策略，首先對靶向基因進(jìn)行敲除，然后將攜帶點(diǎn)突變的同源序列整合到靶位點(diǎn)上，每次編輯過程都需要經(jīng)過2輪單交換菌和雙交換菌的篩選過程，增加了工作量，耗費(fèi)了時間[5]。

最近發(fā)展的CRISPR(the clustered regularly interspaced short palindromic repeat)技術(shù)已成功應(yīng)用于許多物種的基因編輯[6-9]。核酸內(nèi)切酶Cpf1與Cas9相比有許多不同的特性：Cpf1蛋白更小，更利于轉(zhuǎn)化宿主；Cpf1剪切產(chǎn)生黏性末端，更有利于基因編輯后的修復(fù)，而Cas9是平末端剪切；在進(jìn)行多位點(diǎn)編輯時，由于Cpf1本身可以對轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行加工剪切，簡化了crRNA的表達(dá)，而Cas9對應(yīng)的多個sgRNA表達(dá)則需要多個終止子。鑒于CRISPR/Cpf1精準(zhǔn)性和特異性的基因編輯優(yōu)勢，使其更加有利于克服CRISPR/Cas9的限制，在水稻、小鼠和人體細(xì)胞的應(yīng)用中幾乎沒有脫靶效應(yīng)[10-11]。有研究表明C.glutamicum基因組缺少一種SpCas9典型的crRNA序列，造成SpCas9在C.glutamicum中表達(dá)時，對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[12]。所以，在使用Cas9時，研究者發(fā)現(xiàn)非特異密碼子優(yōu)化[13]，或者需要控制Cas9表達(dá)量[5]，才能保證基因編輯的順利進(jìn)行。因此，F(xiàn)rancisellanovicida(Fn)Cpf1蛋白成為首選。在CRISPR-Cpf1/ssDNA系統(tǒng)中，編碼大腸桿菌前噬菌體的重組酶RecT起到了至關(guān)重要的作用，重組酶RecT將合成的單鏈寡脫氧核糖核苷酸合并到基因組中，促進(jìn)ssDNA重組，提高CRISPR-Cpf1系統(tǒng)篩選突變體的效率[14]。本研究建立了CRISPR-Cpf1/ssDNA單質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)，單質(zhì)粒是指pXMJ19質(zhì)粒上同時攜帶靶向特異的crRNA和Cpf1蛋白，并在C.glutamicum中表達(dá)RecT，構(gòu)建了一株嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯捂溎Ｊ骄糜隍?yàn)證和統(tǒng)計基因編輯效率，成功地對其基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行了基因編輯修飾。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

本研究所用菌株見表1。

1.1.2 質(zhì)粒

本研究所用質(zhì)粒見表2。

1.1.3 引物信息

本研究所用引物序列見表3。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in the study

表2 本研究所用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in the study

表3 本研究所用引物Table 3 Primers used in the study

注：下劃線代表酶切位點(diǎn)，斜體代表引物間重疊區(qū)域，小寫字母代表同源臂。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

Mastercycler nexus PCR儀、Eppendorf Eporator電擊轉(zhuǎn)化儀,德國Eppendorf公司；GL20A高速冷凍離心機(jī),日本日立有限公司；UV200紫外可見波長檢測器,美國Laballiance公司；SCD-II高純水裝置,美國Millipore公司。

1.1.5 主要試劑

Primer STAR HS脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)polymerase(2.5 U/μL)、QuickCut限制性內(nèi)切酶(120 U/μL),大連寶生物工程有限公司；Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)MasterMix、Clone Express?ⅡOne Step Cloning Kit,南京諾維贊生物工程有限公司；質(zhì)粒提取及DNA回收試劑盒,上海Omega Bio-tek公司；氯霉素、鹽酸壯觀霉素和卡那霉素,美國Sigma公司。

1.1.6 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，121 ℃滅菌20 min；腦心浸液培養(yǎng)基(brian heart infusion，BHI)：腦心浸液37.5 g/L，121 ℃滅菌20 min；BHIS復(fù)蘇液(g/L)：腦心浸液37.5，葡萄糖 5，115 ℃滅菌15 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以C.glutamicum基因組為模板，用DL-1/DL-2和DL-7/DL-8為引物，分別PCR擴(kuò)增上下游同源臂；以pk18mobsacB質(zhì)粒為模版，用DL-3/DL-4和DL-5/DL-6作為引物，分別擴(kuò)增獲得被拆分的2部分kan#基因片段，并將上述2部分重疊。pk18mobsacB經(jīng)XbaI和KpnI雙酶切線性化，將DNA片段與線性化載體用Clone Express?ⅡOne Step Cloning Kit同源重組酶連接獲得用于構(gòu)建單鏈模式菌M-1的重組質(zhì)粒pk18mobsacB△cgl1890::kan#；以PUC57-Cpf1為模板，用引物CPF-1/CPF-2擴(kuò)增PlacM-Cpf1的基因片段。pXMJ19經(jīng)Hind III單酶切線性化，按照上述同源重組方法獲得質(zhì)粒pXMJ19-PlacM-Cpf1；用引物CPF-3/CPF-2擴(kuò)增Cpf1基因。pXTuf經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切線性化，同上獲得重組質(zhì)粒pXTuf-Cpf1；采用miniGene合成crRNADL，pXMJ19-PlacM-Cpf1質(zhì)粒經(jīng)BamH I單酶切線性化，將二者同源重組獲得切割質(zhì)粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNA；同法獲得切割質(zhì)粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNA；以C.glutamicum基因組作為模板，用引物phET-1/phET-2擴(kuò)增Phom，以E.coli基因組作為模板，用引物phT-3/phET-4擴(kuò)增recT，將質(zhì)粒pEC-XK99E經(jīng)EcoR I和KpnI雙酶切線性化。按照上述同源重組方法獲得pEC-Phom-recT。采用CaCl2介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法[12]獲得重組質(zhì)粒，并按照試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

PCR體系：5×PS Buffer 10 μL、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)mixture (10 mmol/L) 4 μL、上下游引物各2 μL、DNA模板約200 ng、HS酶(5 U/μL) 0.5 μL、ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，適當(dāng)退火溫度下退火15 s，72 ℃延伸適當(dāng)時間(1 min延伸約1 kb)，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

1.2.2 谷氨酸棒狀桿菌電轉(zhuǎn)化法

將重組質(zhì)粒(500 ng)與谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合后加入電轉(zhuǎn)杯，冰浴20 min，電擊，加葡萄糖腦心浸液肉湯(BHIS)復(fù)蘇液，46 ℃水浴熱激6 min，32 ℃、220 r/min條件下復(fù)蘇2 h，涂布于添加相應(yīng)抗生素的BHI培養(yǎng)基平板，32 ℃培養(yǎng)，PCR鑒定目的菌株。

1.2.3 單鏈模式菌M-1的構(gòu)建

采用pk18mobsacB反選擇基因編輯系統(tǒng)[15]。將質(zhì)粒pk18mobsacB△cgl1890::kan#電轉(zhuǎn)化至C.glutamicum感受態(tài)細(xì)胞，利用單交換菌株(鑒定引物S/DL-4)和雙交換菌株(鑒定引物DL-5/A)篩選到重組菌株WT△cgl1890::kan#(M-1)。

1.2.4 質(zhì)粒的消除

采用液體傳代培養(yǎng)的方法，將攜帶質(zhì)粒的目的菌株接種于無抗生素的BHI液體培養(yǎng)基，32 ℃過夜培養(yǎng)，再將菌液稀釋涂布于無抗BHI平板，然后將平板上的單菌落依次分別對點(diǎn)至有抗和無抗平板。選擇在有抗平板上不生長而在無抗平板上生長的菌株，即為成功消除質(zhì)粒的目的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建單鏈模式菌

2.1.1 選擇卡那霉素抗性作為篩選標(biāo)記

為了便于驗(yàn)證和統(tǒng)計CRISPR-Cpf1/ssDNA系統(tǒng)的基因編輯效率，構(gòu)建了1株嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腃.glutamicum單鏈模式菌M-1。菌株M-1的構(gòu)建原理：在cgl1890位點(diǎn)整合了一個移碼突變失活KanR(kan#-cassette)，使用ssDNA(DLK-/DLK+)修復(fù)突變堿基(圖1)，使KanR恢復(fù)[16]，即修復(fù)后的菌株可在含有卡那霉素的BHI平板中正常生長。

圖1 單鏈模式菌M-1基因編輯示意圖Fig.1 Schematic diagram of gene editing for ssDNA model strain M-1

2.1.2 驗(yàn)證單鏈模式菌M-1的KanR嚴(yán)謹(jǐn)性

隨機(jī)選取經(jīng)正確編輯且具有KanR的單菌落進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果如圖2顯示，移碼突變堿基序列TGAC變?yōu)锳TG，說明正確修復(fù)了失活的KanR。由此可見，采用單鏈模式菌M-1驗(yàn)證編輯效率是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，利用KanR篩選標(biāo)記獲得的驗(yàn)證數(shù)據(jù)是可靠的。

圖2 單鏈模式菌KanR的嚴(yán)謹(jǐn)性Fig.2 Rigor of KanR on ssDNA model strain

2.2 CRISPR-Cpf1/ssDNA系統(tǒng)基因組編輯流程

RecT介導(dǎo)的基因編輯流程(圖3-a)：首先，構(gòu)建過表達(dá)recT的重組質(zhì)粒pEC-Phom-recT。構(gòu)建切割質(zhì)粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNA[12]；然后，制備含有RecT的菌株感受態(tài)細(xì)胞，將切割質(zhì)粒和ssDNA同時電轉(zhuǎn)至上述感受態(tài)，涂布含有氯霉素和奇霉素BHI固體培養(yǎng)基，32 ℃過夜培養(yǎng)；再次，隨機(jī)挑選平板中的菌株基因測序；最后，消除質(zhì)粒(進(jìn)行連續(xù)基因操作時，質(zhì)粒pEC-Phom-recT可以保留)?；蚓庉嬛芷跒镹+3 d(N為RecT感受態(tài)細(xì)胞制備的時間)；無RecT介導(dǎo)的基因編輯流程(圖3-b)：操作基本同上，只是該流程省略了RecT感受態(tài)細(xì)胞的制備過程。

P-攜帶Cpf1和crRNA的載體；SpeR-奇霉素抗性基因；CmR-氯霉素抗性基因;a-RecT介導(dǎo)的CRISPR-Cpf/ss DNA系統(tǒng)；b-無RecT介導(dǎo)的CRISPR-Cpf1/SS DNA系統(tǒng)圖3 CRISPR-Cpf1/ssDNA系統(tǒng)基因編輯流程圖Fig.3 A flow-chart for CRISPR-Cpf1/ssDNA gene editing

2.3 優(yōu)化CRISPR-Cpf1/ssDNA系統(tǒng)的切割致死作用

CRISPR-Cpf1系統(tǒng)由一段向?qū)NA引導(dǎo)，識別靶基因位點(diǎn)的PAM(protospacer adjacent motif)，再與核酸內(nèi)切酶蛋白結(jié)合實(shí)現(xiàn)特定DNA靶向切割[17]，即Cpf1-crRNA復(fù)合物可以結(jié)合靶DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)[18-19]。DSB是一種功能強(qiáng)大的反選擇標(biāo)記，它可以提供一種選擇壓力用于供體DNA模板修復(fù)，保證較高的基因編輯效率[20-22]。由于CRISPR-Cpf1系統(tǒng)誘導(dǎo)的DSB對C.glutamicum具有致死性，因此crRNA的靶向切割效率通過菌株細(xì)胞的存活轉(zhuǎn)化子數(shù)量(colony forming units，c.f.u.)來反映[23-25]。低靶向效率的crRNA在基因組編輯過程中會導(dǎo)致很高的假陽性率，導(dǎo)致群體中許多野生型細(xì)胞存活。因此，建立CRISPR基因編輯系統(tǒng)時，首先要構(gòu)建切割質(zhì)粒，并驗(yàn)證其是否具有良好的切割作用。一個單一成熟的crRNA包含一段20 bp保守序列和一段24 bp的靶向序列。本研究將Cpf1和crRNA同時置于切割質(zhì)粒上，當(dāng)crRNA中富含胸腺嘧啶的。crRNA-cassette包含啟動子Pj23119、靶基因位點(diǎn)的crRNA和終止子rrnb。

為了選擇更好的方式表達(dá)Cpf1，提高基因組切割效率，比較了啟動子Ptuf和PlacM對切割效率的影響，靶位點(diǎn)設(shè)計在單鏈模式菌M-1的突變位點(diǎn)，分別構(gòu)建切割質(zhì)粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNADL和pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNADL。將切割質(zhì)粒和對照質(zhì)粒pXMJ19-Cpf1分別電轉(zhuǎn)至菌株M-1的感受態(tài)細(xì)胞，涂布固體BHI培養(yǎng)基(氯霉素)，統(tǒng)計平板中漏切的轉(zhuǎn)化子數(shù)量。

如圖4所示，當(dāng)沒有crRNA時，對照組Ptuf和PlacM存活細(xì)胞數(shù)(個)分別約為3.35×103和3.72×103，說明對照質(zhì)粒pXMJ19-Cpf1并不起切割作用。然而，切割質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子數(shù)量明顯少于對照組，說明切割質(zhì)粒發(fā)揮了良好的切割致死作用；當(dāng)crRNA存在時，Ptuf和PlacM組存活細(xì)胞數(shù)分別大幅下降，Ptuf組漏切的轉(zhuǎn)化子數(shù)量明顯少于PlacM組，說明Ptuf啟動子更加有助于Cpf1的表達(dá)，切割質(zhì)粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNA切割效果更好，若采用啟動子Ptuf更加有助于提升基因編輯效率。

圖4 CRISPR-Cpf1系統(tǒng)切割作用Fig.4 Cutting effect of CRISPR-Cpf1 system

2.4 優(yōu)化CRISPR-Cpf1/ssDNA系統(tǒng)的重組作用

由于DSB對大多數(shù)缺乏非同源末端連接(NHEJ)機(jī)制的細(xì)菌是致命的[26]，因此，為了提高經(jīng)DNA雙鏈斷裂后被修復(fù)的菌株存活率，需要一個外來修復(fù)模板刺激DNA修復(fù)通路，對斷裂的靶位點(diǎn)進(jìn)行同源定向修復(fù)。

2.4.1 RecT對ssDNA基因重組的影響

谷氨酸棒狀桿菌自身的同源重組能力較低，通常需要借助重組酶提高其重組能力。在RecET重組系統(tǒng)中，RecT是DNA退火蛋白和單鏈結(jié)合蛋白[27]。因此，本研究嘗試用RecT提高CRISPR-Cpf1/ssDNA系統(tǒng)的重組作用。將前導(dǎo)鏈和滯后鏈分別電轉(zhuǎn)至兩種單鏈模式菌M-1的感受態(tài)細(xì)胞(-RecT或+RecT)，涂布含有卡那霉素的BHI固體培養(yǎng)基，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化子數(shù)量。

如圖5所示，首先，滯后鏈的轉(zhuǎn)化子數(shù)量高于前導(dǎo)鏈，說明滯后鏈的重組作用優(yōu)于前導(dǎo)鏈；其次，當(dāng)菌株表達(dá)RecT時，被成功修復(fù)且具有KanR的轉(zhuǎn)化子數(shù)量高于-RecT組，并且滯后鏈+RecT組的重組作用比-RecT組提高了25%。由此可見，RecT可對單鏈重組起到促進(jìn)作用。

圖5 RecT對單鏈重組的影響Fig.5 Effect of RecT on ssDNA recombination

2.4.2 優(yōu)化ssDNA長度

當(dāng)發(fā)生DSB雙鏈斷裂時，可通過同源重組作用將斷裂位點(diǎn)修復(fù)，且通過增加同源臂長度提高同源重組效率，從而提高細(xì)胞存活率。有相關(guān)研究采用了長度為59 bp的ssDNA進(jìn)行了基因編輯[12]。為了更加系統(tǒng)的研究單鏈長度對重組作用的影響，本文參考上述報道中所使用的單鏈長度，同時考慮到引物合成成本的因素，將長度范圍為30～70 bp的ssDNA(滯后鏈，DLK+)和切割質(zhì)粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNADL電轉(zhuǎn)至菌株M-1的感受態(tài)細(xì)胞(+RecT)，涂布含有卡那霉素的BHI平板，統(tǒng)計平板中轉(zhuǎn)化子數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，被正確編輯的且具有KanR的轉(zhuǎn)化子數(shù)量隨著ssDNA長度的增加而增加。當(dāng)ssDNA長度達(dá)到70 bp時，ssDNA重組作用最佳。

圖6 單鏈ssDNA長度對基因重組的影響Fig.6 Effect of ssDNA length on gene recombination

2.4.3 優(yōu)化ssDNA添加量

當(dāng)ssDNA被轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌株細(xì)胞后，大部分會被細(xì)胞自身降解，只有很小一部分ssDNA會發(fā)揮重組作用。有相關(guān)研究采用了10 μg的ssDNA進(jìn)行了基因編輯[12]。為了深入研究單鏈添加量對重組作用的影響，獲得最佳添加量，本文參考上述報道中所使用的添加量，同時考慮到引物合成成本的因素，將添加量為2.5～12.5 μg的ssDNA(滯后鏈，DLK+，70 bp)和切割質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)至菌株M-1的感受態(tài)細(xì)胞(+RecT)，涂布含有卡那霉素的BHI平板，統(tǒng)計平板中轉(zhuǎn)化子數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)化子數(shù)量隨著ssDNA濃度的增加而增加，當(dāng)添加量達(dá)到12.5 μg時，被正確修復(fù)且具有KanR的菌落數(shù)達(dá)到最高值。說明合理增加ssDNA濃度會促進(jìn)ssDNA重組作用。

圖7 單鏈ssDNA添加量對基因重組的影響Fig.7 Effect of ssDNA addition on gene recombination

2.5 RecT介導(dǎo)的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因編輯效率

為了統(tǒng)計RecT介導(dǎo)的ssDNA基因編輯效率，按照2.2節(jié)所示的基因編輯流程方法將ssDNA(滯后鏈DLK+、添加量12.5 μg、長度70 bp)和切割質(zhì)粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-crRNADL同時電轉(zhuǎn)至單鏈模式菌M-1的感受態(tài)細(xì)胞(-RecT/+RecT)，涂布含有氯霉素的BHI固體培養(yǎng)基，再對點(diǎn)卡那霉素BHI固體培養(yǎng)基，統(tǒng)計ssDNA基因編輯效率，計算公式如下所示，

(1)

如圖8所示，當(dāng)無RecT時，ssDNA編輯效率分別為(15%±2.4)%(按照公式(1)計算3組平行試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化子數(shù)之比：6/50、8/52、10/60)；當(dāng)有RecT時，編輯效率分別為(80±5.7)%(19/22、18/24、20/25)，是無RecT時的5.3倍。由此可見，優(yōu)化后的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因編輯系統(tǒng)，在Ptuf切割質(zhì)粒和重組酶RecT的雙重作用下，提高了突變菌株的篩選效率。

圖8 RecT介導(dǎo)的CRISPR-Cpf1/ssDNA系統(tǒng)基因編輯效率Fig.8 Gene editing efficiency of RecT-CRISPR-Cpf1/ssDNA system

3 結(jié)論

本研究建立了RecT介導(dǎo)的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因編輯系統(tǒng)，對切割和重組兩方面進(jìn)行了深入研究，通過利用啟動子Ptuf優(yōu)化了切割效率以及對比不同ssDNA長度和添加量優(yōu)化了重組效率。確定的最佳基因編輯方案為：ssDNA(滯后鏈)的添加量為12.5 μg，ssDNA的長度為70 bp。優(yōu)化后的基因編輯效率為(80±5.7)%，可有效地對基因靶點(diǎn)進(jìn)行編輯修復(fù)?？蛇M(jìn)一步嘗試研究該系統(tǒng)的多基因定點(diǎn)編輯，使其在C.glutamicum基因組代謝工程改造中發(fā)揮更大的應(yīng)用價值與潛力。