祁永凱，肖延銘＊，張飛龍，華超，葛文強(qiáng)，李敬亞，梁阿朋

（1.長(zhǎng)興制藥股份有限公司，浙江長(zhǎng)興 313100；2.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

鹽酸甲氧那明又稱(chēng)甲氧苯丙甲胺鹽酸鹽（C11H17ON·HCl），是一類(lèi)β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，相比較麻黃堿的平喘作用更加有效，對(duì)于心血管系統(tǒng)產(chǎn)生的副作用較少，臨床上多以復(fù)方制劑的形式使用。復(fù)方甲氧那明中各單藥均以小劑量組合，在臨床上卻能發(fā)揮良好的支氣管解痙作用[1]，多用于不能耐受麻黃堿的支氣管哮喘患者[2-4]，復(fù)方甲氧那明膠囊具有止咳、祛痰、平喘等作用，有臨床指標(biāo)及臨床有效率證明，大大縮短了病程，減少了患者痛苦[5]。

一般制備甲氧那明的方法是以2-甲氧基苯甲醛為起始物，在堿性條件下硝基乙烷與其發(fā)生縮合反應(yīng)。在鹽酸作用下，鐵與三氯化鐵將其還原成2-甲氧基苯丙酮，最后加入甲胺的鹽酸鹽，利用硼氫化鈉還原胺化，繼而制備得到鹽酸甲氧那明[6-8]。由于氧化鉑與硝基乙烷價(jià)格較高且三氯化鐵與鐵的使用會(huì)產(chǎn)生大量的廢水廢渣，處理成本較高，在環(huán)保監(jiān)管越來(lái)越嚴(yán)的形勢(shì)下，顯得舉步維艱。目前，國(guó)外報(bào)道的合成方法是采用金屬催化氫化反應(yīng)：利用氧化鉑作催化2-甲氧基苯基丙酮，在甲胺甲醇溶液中加壓氫化反應(yīng)1～3 h，收率達(dá)到90%以上。Zenichi H等[9]報(bào)道了另外的一個(gè)合成方法，將2-甲氧基苯基丙酮與30%的甲胺甲醇溶液混合，用雷尼鎳和二氯化鉑催化氫化。國(guó)內(nèi)也有部分企業(yè)直接采用鈀碳直接催化氫化[10]。日本專(zhuān)利JP3101022報(bào)道了鹽酸甲氧那明的合成方法，以鄰甲氧基苯基丙酮和硝基甲烷為原料，在汞-鋁催化劑的條件下回流4～5 h，產(chǎn)率達(dá)到81%以上。上述合成方法要用到氧化鉑、二氯化鉑、鈀碳作為催化劑，大大增加生產(chǎn)成本，易產(chǎn)生環(huán)境污染，且加氫反應(yīng)危險(xiǎn)性較高。

本文通過(guò)化學(xué)法與生物酶法的結(jié)合，采用化學(xué)酶法催化合成鹽酸甲氧那明中間體2-甲氧基苯基異丙醇，再通過(guò)化學(xué)法制備最終成品，盡可能地減少有機(jī)溶劑等其他化學(xué)試劑的使用，避免采用氫化反應(yīng)，提高制備安全性與環(huán)保經(jīng)濟(jì)性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian NMR-400 MHz型核磁共振儀，Waters液相檢測(cè)器。

質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔試劑盒，均購(gòu)自Axygen公司；限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶，均購(gòu)自TaKaRa公司；全基因合成和基因測(cè)序，由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司提供；胰蛋白胨、酵母提取物，購(gòu)自O(shè)xoid公司。

醋酐（C4H6O3）、2-甲氧基苯乙酸（C9H10O3）、N-甲基咪唑（C4H6N2）、氫氧化鈉（NaOH）、二氯甲烷（DCM）、鹽酸（HCl）、葡萄糖（C6H12O6）輔酶——煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、碳酸鈉（Na2CO3）、對(duì)甲苯磺酰氯（TsCl）、對(duì)甲苯磺酸（TsOH）、丙酮（CH3COCH3）和乙醇（CH3CH2OH）均為市售分析純，葡萄糖脫氫酶（Glucose dehydrogenase，GDH）酶液由長(zhǎng)興制藥股份有限公司制備。

1.2 合成方法

1.2.1 催化合成所需基因在大腸桿菌中表達(dá)

將來(lái)源于新鞘脂菌（Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444）的羰基還原酶（Short-chaindehydrogenase/reductase，SDR，GenBank：CP000677.1）由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成，獲得重組質(zhì)粒pET28a-SDR，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，獲得大腸桿菌重組表達(dá)菌株BL21（DE3）/pET28a-SDR。挑取單菌落接入50 mL含有卡那霉素的LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl，pH 7.0）培養(yǎng)基中，37.0 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。將8 mL過(guò)夜培養(yǎng)物接種于800 mL含有卡那霉素的TB（24 g/L酵母膏、12 g/L胰蛋白胨、5 g/L甘油、2.31 g/L KH2PO4、16.4 g/L K2HPO4·3H2O，pH 7.0）培養(yǎng)基中，37.0 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)，至發(fā)酵液OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.2 mmoL/L的IPTG，25.0 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)14 h。發(fā)酵完畢后，5 000 r/min離心15 min，收集菌泥。

1.2.2 粗酶液的制備

在燒杯中加入30 g SDR菌泥，倒入50 mmol/L pH 7.0的PBS緩沖液至總體積為100 mL，振蕩搖勻，重懸菌體，利用超聲波破碎儀破壁30 min，即獲得含有目的蛋白，濃度為300 g/L的SDR粗酶液。GDH粗酶液制備方法同上。

1.2.3 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）的制備

在室溫條件下，1 L三口瓶中加入500 g醋酐，攪拌加入300 g 2-甲氧基苯乙酸（Ⅰ）并升溫至60 ℃，攪拌30 min后，緩慢滴加30 g N-甲基咪唑，滴畢繼續(xù)攪拌30 min后升溫至130 ℃回流5 h，關(guān)停反應(yīng)。減壓蒸餾除去過(guò)量的醋酐，待冷卻至室溫后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的NaOH 300 mL，攪拌30 min后，加入DCM萃取3次，每次200 mL，合并的有機(jī)層用100 mL 2 mol/L的HCl洗滌后，常壓蒸餾回收DCM，然后減壓蒸餾，收集80～90 ℃（2 kPa）的餾分，得221 g 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）[11]。產(chǎn)率73.2%，經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度達(dá)到98.5%以上。

核磁確證：1H-NMR (CDCl3,ppm) 1.21(s,3H),2.05(br,1H),2.721 (dd,J=7.6Hz,13.6 Hz,1H),2.845 (dd,J=4.6 Hz,13.6 Hz,1H),3.821(s,3H),4.030～4.076(m,1H),6.857～6.924 (m,2H),7.128～7.248 (m,2H)。

1.2.4 酶催化制備2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）

在圓底燒瓶中先后加入100 g底物2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）、1 000 mL水、165 g（1.5 eq）葡萄糖、250 mg 0.2 g/L的NAD、質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右，溫度保持約37.0 ℃，充分?jǐn)嚢枞芙夂蟾骷尤?00 mL SDR粗酶液與200mL GDH粗酶液，繼續(xù)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至7，最后加入剩余體積的水使得初始總體積控制在2.0 L。反應(yīng)約12 h后，點(diǎn)板檢測(cè)2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）完全耗盡。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心，取上層清液，棄去酶渣。用DCM萃取清液，合計(jì)3次，每次200 mL，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥2 h。減壓旋干并回收DCM，得到淡黃色油狀物76 g，產(chǎn)率76%，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為99.1%。

核磁確證：1H-NMR（CDCl3，ppm） 2.122(s,3H,COCH3),3.663(s,2H,COCH2),3.903(s,3H,OCH3),6.865～6.938 (m,2H,ArH),7.11 (dd,J=1.6 Hz,J =7.2 Hz,1H,ArH),7.25(dt,J =1.6 Hz,8Hz,1H,ArH)。

1.2.5 2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)，取2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）50 g、三乙胺36.5 g（1.2 eq）、500 mL干燥的DCM，0 ℃環(huán)境下攪拌15 min，再開(kāi)始滴加TsCl 68 g（1.2 eq），滴加完畢后繼續(xù)攪拌30 min后恢復(fù)常溫?cái)嚢? h。反應(yīng)完畢后，用飽和NaHCO3溶液水洗2次，每次200 mL，收集有機(jī)相。旋干DCM，得到油狀中間體C17H20O4S（Ⅳ）78 g，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度約82%，收率83%。

取上述中間體1-（2-甲氧基苯基）-2-（4-甲基苯磺酸酯）-丙基（Ⅳ）50 g，溶于100 mL DMF中，后加入對(duì)甲苯磺酸32 g（1.2 eq）、甲胺乙醇溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)33%）8 g（1.5 eq），60 ℃回流24 h。點(diǎn)板檢測(cè)反應(yīng)完畢。加入200 mL飽和Na2CO3溶液水洗，200 mL的DCM萃取溶液2次，合并有機(jī)相。旋干DCM，殘留物進(jìn)行減壓蒸餾。收集110～120℃（2 kPa）的餾分，得到32.2 g 2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ），淡黃色液體，收率79%，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為98.5%。

核磁確證：1H-NMR(400 MHz,DMSO)d： 1.24(d,J=8.0 Hz,3H,CH3),2.53 (dd,J1=10.0 Hz,J2=6.0 Hz,Ha,CH2) 2.79 (dd,J1=10.0 Hz,J2=6.0 Hz,Hb,CH2),3.20(m,1H,CH),3.81(s,3H,CH3),6.89～7.21(m,4H,Ar-H);13C-NMR(100 MHz,DMSO) d：20.8,33.7,38.5,56.1,59.5,112.4,121.3,127.0,127.7,130.6,158.7。

1.2.6 鹽酸甲氧那明（Ⅵ）的合成

在1 L三口瓶中加入90 g 2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）和500 mL無(wú)水丙酮，0～5 ℃下通入氯化氫氣體2 h，有白色沉淀產(chǎn)生，抽濾，用丙酮洗滌，濾餅用乙醇甲苯混合溶劑重結(jié)晶，得78.9 g鹽酸甲氧那明（Ⅵ）[11]，收率72%，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為99.5%。

核磁確證：1H-NMR(D2O,ppm) 1.16(d,J=6.8 Hz,3H,),2.597(s,3H),2.839(dd,J=6.8 Hz,14Hz,1H),2.932(dd,J=6.4 Hz,14Hz,1H),3.45(m,1H),3.765(s,3H),6.922(t,J=7.6 Hz,1H),6.985(d,J=6.8 Hz,,1H),7.16(d,J=7.2 Hz,1H),7.281(t,J=8.0 Hz,1H)。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響酶催化2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）純度與收率的因素

2.1.1 輔酶NAD的量對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

控制不同組別NAD當(dāng)量，反應(yīng)12 h取樣測(cè)量產(chǎn)物2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）的純度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 輔酶NAD含量對(duì)反應(yīng)純度的影響

由圖1可知，輔酶NAD的量控制在0.15～0.30 g/L區(qū)間，反應(yīng)產(chǎn)物的純度均能達(dá)到99.0%以上，繼續(xù)加大其投量對(duì)純度沒(méi)有較大的提升，考慮到經(jīng)濟(jì)性，輔酶NAD的量應(yīng)控制在控制在0.2 g/L。其對(duì)反應(yīng)的收率影響較小。

2.1.2 投酶量對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

加入不同體積SDR粗酶液與GDH粗酶液以控制初始投酶量，反應(yīng)12 h取樣測(cè)量產(chǎn)物2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）純度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 投酶量對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

由圖2可知，當(dāng)SDR粗酶液與GDH粗酶液各加入200 mL時(shí)，體系SDR與GDH初始菌濃均為30 g/L，最終產(chǎn)物純度能達(dá)到99%以上，再繼續(xù)加大投酶量提高菌濃，產(chǎn)物純度變化不大，但是由于菌泥量的增加對(duì)于后處理產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致收率會(huì)有所降低。綜上結(jié)果，SDR與GDH菌濃的初始值為30 g/L時(shí)，產(chǎn)物2-甲氧基苯丙醇（Ⅲ）經(jīng)HPLC檢測(cè)純度大于99.0%以上且收率理想。

2.1.3 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）濃度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

加入不同質(zhì)量的底物2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）控制底物的濃度，反應(yīng)12 h取樣測(cè)量產(chǎn)物2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）的純度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）濃度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

由圖3可知，在當(dāng)前反應(yīng)條件下，能反應(yīng)的最大濃度為50～80 g/L，且能保證純度大于99.0%，隨著2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）濃度的增加，會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用，降低酶活，只有繼續(xù)加大酶用量才能保證反應(yīng)完畢，酶量的增加會(huì)勢(shì)必加大生產(chǎn)的成本。

由圖4可知，當(dāng)2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）濃度提升到100 g/L時(shí)，達(dá)到產(chǎn)物純度99.1%以上需要將酶量加大到至少90 g/L，投酶量的增加加大了成本。綜合考慮，2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）的濃度控制在80 g/L較為適宜。

圖4 100g/L 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）反應(yīng)完全所需酶量

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在（37.0±0.5）℃酶催化反應(yīng)中2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）純度最佳，經(jīng)HPLC檢測(cè)達(dá)到99.0%以上。

2.1.5 反應(yīng)pH對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

圖6 反應(yīng)pH對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的Na2CO3溶液動(dòng)態(tài)控制pH至設(shè)定值，反應(yīng)12 h取樣測(cè)量產(chǎn)物2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）的純度。由圖6可知，當(dāng)反應(yīng)pH保持在7.0左右，酶催化活力最佳，2-甲氧基苯基異丙醇（Ⅲ）純度經(jīng)HPLC檢測(cè)達(dá)到99.0%以上。

2.2 影響2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）純度與收率的因素

（1）投料摩爾比對(duì)反應(yīng)中間體1-（2-甲氧基苯基）-2-（4-甲基苯磺酸酯）-丙基（Ⅳ）純度及收率的影響。

表1 投料摩爾比對(duì)1-（2-甲氧基苯基）-2-（4-甲基苯磺酸酯）-丙基（Ⅳ

由表1可知，當(dāng)n(C17H20O4S)、n(TEA)、n(TsCl)的比例為1.0∶1.2∶1.2時(shí)，中間體（Ⅳ）HPLC檢測(cè)純度達(dá)到81.4%，收率83.3%為最佳摩爾比。

（2）投料摩爾比對(duì)2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）純度及收率的影響。

表2 投料摩爾比對(duì)2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）純度及收率的影響

由表2可知，當(dāng)n(C10H14O2)、n(PTS)、n(CH5N)的比例為1.0∶1.2∶1.5時(shí)，2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）經(jīng)HPLC檢測(cè)純度達(dá)到98.5%，收率79.1%為最佳摩爾比。

3 結(jié)論與展望

本研究是通過(guò)有機(jī)合成與生物催化技術(shù)的交叉結(jié)合與集成，改進(jìn)醫(yī)藥化學(xué)品鹽酸甲氧那明的合成路線，設(shè)計(jì)和改良了一種利用化學(xué)酶法合成鹽酸甲氧那明的新工藝，2-甲氧基苯乙酸為初始原料，經(jīng)還原、酶催化、羥氨基化制備鹽酸甲氧那明。對(duì)酶催化工藝中反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、輔酶NAD用量，2-甲氧基苯基異丙醇濃度投酶量等因素進(jìn)行了考察。對(duì)羥氨基化制備中，三乙胺、對(duì)甲苯磺酰氯、對(duì)甲苯磺酸、甲胺乙醇溶液的摩爾投料比進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了較優(yōu)的工藝路線，制備步驟進(jìn)一步簡(jiǎn)化，有機(jī)溶劑及試劑使用量少，三廢排量少，收率高，具有良好的工業(yè)生產(chǎn)前景。生物催化必將為有機(jī)合成技術(shù)的發(fā)展、應(yīng)用提供更多技術(shù)、產(chǎn)品及產(chǎn)業(yè)機(jī)會(huì)。