劉鳳錦，盧興，李玉霞，邵曉園，李高聰，陸延，張軍

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500；3.黑龍江佰益食品發(fā)展有限公司，哈爾濱150078）

0 引言

甜玉米是兼具果、蔬特性的谷物，含糖量高出普通玉米10倍，富含多種維生素，蛋白質(zhì)含量較普通玉米高[1-2]。我國(guó)甜玉米深加工技術(shù)落后，產(chǎn)品形式單一，附加價(jià)值低[3]。開發(fā)甜玉米的精深加工技術(shù)，豐富產(chǎn)品的種類，擴(kuò)大其利用水平和能力，是食品科技工作者和消費(fèi)者共同關(guān)注的問題[4-5]。乳清蛋白在消化過程中產(chǎn)生多種生物活性多肽,具有增強(qiáng)體質(zhì)、提高免疫力、抗疲勞、抗氧化、抑菌抗病毒、降血脂、降血壓、降血糖、抗癌等多種保健功能[6]。利用乳酸菌和乳清蛋白提升甜玉米蛋白質(zhì)效價(jià)開發(fā)出的甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料，是現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)在谷物和乳制品混合原料深加工領(lǐng)域的具體應(yīng)用，對(duì)提升適口性、儲(chǔ)藏性和營(yíng)養(yǎng)性具有重要意義，符合當(dāng)前飲料的發(fā)展消費(fèi)趨勢(shì)，市場(chǎng)前景廣闊[7-8]。為甜玉米資源的深加工利用開辟了新的應(yīng)用途徑[9]。

以往食品發(fā)酵技術(shù)研究的焦點(diǎn)都集中在發(fā)酵速率上，所以發(fā)酵菌種的篩選以產(chǎn)酸能力和速率為指標(biāo)[10]。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)及科技進(jìn)步，消費(fèi)者營(yíng)養(yǎng)與健康意識(shí)不斷增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)、功能和感官評(píng)價(jià)已成為食品開發(fā)的綜合體系，取代感官評(píng)價(jià)的片面做法[11]。

本研究以甜玉米粒和分離乳清蛋白粉為原料，以植物乳桿菌（L.plantarum）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）、干酪乳桿菌（L.actobacilluscasei）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）為發(fā)酵菌種，通過分析發(fā)酵過程中pH；還原糖消耗量；可溶性蛋白，游離氨基氮；可滴定酸度主要品質(zhì)指標(biāo)的變化，并結(jié)合感官評(píng)價(jià)，綜合評(píng)價(jià)不同菌種發(fā)酵甜玉米乳清蛋白飲料的特性，為進(jìn)一步開發(fā)發(fā)酵乳品種做理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

直投式乳桿菌凍干粉：植物乳桿菌（L.plantarum）（DAN ISCO公司）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）(普爾斯天津國(guó)際貿(mào)易有限公司)、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）(普爾斯天津國(guó)際貿(mào)易有限公司)、干酪乳桿菌（L.actobacilluscasei）（普爾斯天津國(guó)際貿(mào)易有限公司），4種乳酸菌皆為兼性厭氧菌。

1.1.2 原材料及試劑

甜玉米粒（黑龍江佰益食品發(fā)展有限公司提供）；速溶乳清分離蛋白（蛋白質(zhì)含量93%北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3Cp H計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PB203-N電子精密天平：梅特勒TU-1810型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HW S-12電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料制作方法

參照李鳳林等[12]制備澄清型玉米發(fā)酵飲料工藝技術(shù)，結(jié)合甜玉米原料營(yíng)養(yǎng)特性分析，采用如下方法，制備甜玉米發(fā)酵飲料。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）室溫下解凍甜玉米，在（水與甜玉米質(zhì)量比為1∶4）預(yù)煮15 m in，料理機(jī)內(nèi)打漿5 m in。

（2）乳清蛋白粉用45℃純凈水配制2%濃度液與甜玉米漿1∶1充分混合。

（3）將料液冷卻到37℃左右接種，混合均勻后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

參照孫曉昕等[13]的方法，依據(jù)《GBT 16291.2-2010感官分析選拔、培訓(xùn)和管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則第2部分：專家評(píng)價(jià)員》、《GBT 16291.1-2012感官分析 選拔、培訓(xùn)與管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則第1部分：優(yōu)選評(píng)價(jià)員》選拔、培訓(xùn)5名評(píng)審專家和35名普通消費(fèi)者評(píng)價(jià)員，對(duì)經(jīng)L.plantarum、L.actobacillus casei、L.acidophilus、L.rhamnosus發(fā)酵12 h，并4℃冷藏24 h后的甜玉米乳清蛋白飲料，從香氣、口感、色澤、狀態(tài)4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，總共100分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見表1[14]。

表1 甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料感官品評(píng)標(biāo)準(zhǔn)表

1.3.4 過程指標(biāo)分析

自發(fā)酵開始第0、2、4、6、8、10、12 h分別取樣，并采用相應(yīng)方法測(cè)定下列變量。

1.3.5 pH值的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.6 可滴定酸度的測(cè)定

借鑒張莉麗等[15]方法，準(zhǔn)確稱量5.00 g發(fā)酵樣品，置于100 m L三角瓶中，加入40 m L去CO2水，再加入2滴的0.5%酚酞乙醇溶液，小心搖勻，用濃度為0.1 m ol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色在30 s內(nèi)不消失為止。消耗的濃度為0.1 m o l/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)除以樣品克數(shù)，再乘以1000，即得酸度（°T），取3次測(cè)定的平均值。

1.3.7 還原糖的測(cè)定

參照楊貴明等[16]的方法，配制一系列梯度濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長(zhǎng)520 nm下測(cè)其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。每2 h取甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料，稀釋10倍后，在相同條件下測(cè)定樣品的吸光度值，根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算乳酸菌發(fā)酵過程中還原糖含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)平行3次。

1.3.8 可溶性蛋白的測(cè)定

參照Sheih IC等[17]方法，配制一系列梯度濃度的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，并繪制牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。每2 h取甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料，稀釋10倍后，在相同條件下測(cè)定樣品的吸光度值，根據(jù)牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算乳酸菌發(fā)酵過程中可溶性蛋白質(zhì)含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)平行3次。

1.3.9 游離氨基氮的測(cè)定

參照Salm erón I等[18]的方法，進(jìn)行一定改進(jìn)，測(cè)定甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料發(fā)酵過程中的游離氨基態(tài)氮。配置一系列梯度濃度的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制亮氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。每2 h取甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料，稀釋10倍后，按上述操作步驟測(cè)定樣品的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算乳酸菌發(fā)酵過程中游離氨基氮含量。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理用O riginPro8.5處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH值測(cè)定結(jié)果

圖1 pH值變化曲線

圖1 表明，甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料起始pH值為6.85。L.rhamnosus發(fā)酵液，pH值下降速率最慢，前4 h基本沒有變化，下降速率僅為0.16/h，發(fā)酵8 h，p H值為6.22，即使進(jìn)一步發(fā)酵到12 h時(shí)pH值仍為4.93。L.plantarum在發(fā)酵過程中，前8 hpH值下降速率最快，pH值下降平均速率為0.31/h，在發(fā)酵2 h時(shí)，便開始急速下降，最早啟動(dòng)酸發(fā)酵過程，以最快速率到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)(p H=4.30)，發(fā)酵時(shí)間8 h，之后p H值基本不變，顯示后酸化能力較弱。L.acidophilus、L.actobacillus casei發(fā)酵液pH值變化規(guī)律基本一致，L.acidophilus發(fā)酵8 h后也達(dá)到pH=4.30水平，pH下降速率為0.26/h，表現(xiàn)出和L.plantarum相近的酸發(fā)酵能力，不同的是，在8 h后p H值繼續(xù)下降，后酸化能力較強(qiáng)。L.actobacillus casei發(fā)酵液pH下降速率較平穩(wěn)為0.27/h，在經(jīng)過12 h發(fā)酵后，pH下降到3.91。

2.2 發(fā)酵過程中可滴定酸度測(cè)定結(jié)果

圖2 可滴定酸度變化曲線

圖2 顯示，相同條件下，4種發(fā)酵過程中可滴定酸度上升趨勢(shì)基本一致，但是上升速率差別較大。L.plantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料可滴定酸度上升速率在整個(gè)發(fā)酵過程中均高于其他幾種，約為2.37°T/h，發(fā)酵12 h可滴定酸度為44.60°T，說明其發(fā)酵過程中產(chǎn)酸最快，與pH變化趨勢(shì)相符合；L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料在發(fā)酵過程中，可滴定酸度上升速率最小，僅為1.82°T/h，產(chǎn)酸能力較差，驗(yàn)證了其在發(fā)酵過程中pH下降最慢的結(jié)果，發(fā)酵12 h可滴定酸度僅為38.10°T；L.actobacillus casei和L.acidophilus發(fā)酵液可滴定酸度上升速率分別為2.18°T/h和2.28°T/h，12 h可滴定酸度分別達(dá)到42.30°T和43.80°T。

2.3 發(fā)酵過程中還原糖消含量測(cè)定結(jié)果

圖3 還原糖含量變化曲線

圖3 表明，4種發(fā)酵液還原糖含量的變化，呈現(xiàn)下降-上升-平穩(wěn)-下降的臥S型一致走勢(shì)，區(qū)別在于變化程度，這與pH值及滴定酸度的變化趨勢(shì)和強(qiáng)度相符，表明4種乳酸菌利用還原糖進(jìn)行酸發(fā)酵能力有明顯差異。L.plantarum、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量變化趨勢(shì)前期基本一致，6 h后出現(xiàn)分化。L.acidophilus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量呈線性下降。L.plantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料則在8 h后開始線性下降，且于10 h后趨于穩(wěn)定。L.rhamnosus、L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量變化趨勢(shì)基本一致，僅在前2 h稍有下降后便開始上升，直至8 h開始線性急速下降。不同點(diǎn)在于L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量一直高于L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料，且在第4 h達(dá)到高峰值9.10 g/L，超出甜玉米乳清蛋白原液中的固有還原糖含量，顯示其具有較強(qiáng)的淀粉降解能力，10 h后趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵前2h,L.plantarum、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量下降速率最快，分別為2.29 g/（L·h），2.35 g/（L·h），而L.rhamnosus、L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖消耗速率較低，僅為1.18 g/（L·h），0.51g/(L·h）。在發(fā)酵2～4 h，L.plantarum、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量迅速增長(zhǎng)，而L.actobacillus casei、L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量緩慢增長(zhǎng)，說明在發(fā)酵過程中前2 h乳酸菌消耗存量還原糖含量至最低點(diǎn)后，開始產(chǎn)生新的還原糖，有了增量還原糖，并在發(fā)酵的4～8 h一直產(chǎn)生還原糖并保持含量處于6.50 g/L的相對(duì)高位，其中L.acidophilus發(fā)酵甜玉米乳清蛋白飲料還原糖含量在6 h以后呈現(xiàn)線性下降。在發(fā)酵10 h后，4種乳酸菌甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量均有較大幅度的減小，均下降到3.50 g/L左右的水平。10～12 h時(shí)，L.rhamnosus、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量繼續(xù)下降，L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量又緩慢上升，而L.plantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料還原糖含量基本不變。

2.4 發(fā)酵過程中可溶性蛋白測(cè)定結(jié)果

圖4 可溶性蛋白含量變化曲線

由圖4可知，4種乳酸菌發(fā)酵甜玉米乳清蛋白飲料的過程中，可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)基本一致，在發(fā)酵前2 h都呈下降趨勢(shì)，其中L.acidophilus、L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料可溶性蛋白含量下降速率較大，分別約為2.60m g/(g·h)，2.43 m g/(g·h)。在發(fā)酵2～6 h階段，除L.p lantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料可溶性蛋白含量繼續(xù)下降至第4 h開始回升外，其余都在第2 h后開始回升，且L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料可溶性蛋白含量增長(zhǎng)速率最快，約為1.85 m g/(g·h)。這可能是前期乳酸菌利用可溶性蛋白生長(zhǎng)繁殖，致使可溶性蛋白含量下降，而當(dāng)乳酸菌大量繁殖后，分泌蛋白酶進(jìn)一步水解玉米中的蛋白質(zhì)而使可溶性蛋白含量增高。在發(fā)酵6～10 h階段，除了L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料可溶性蛋白含量繼續(xù)增長(zhǎng)至第8 h外，其他3種乳酸菌甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料中可溶性蛋白含量均在減小。L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料可溶性蛋白含量在第8 h達(dá)到最高點(diǎn)23.20 m g/g后，和其余乳酸菌一樣開始急速下降。4種乳酸菌甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料可溶性蛋白含量在8～10 h期間都呈現(xiàn)出急速下降趨10 h后，下降速率明顯減緩，12 h后均達(dá)到5.30 m g/g上下水平。

2.5 發(fā)酵過程中游離氨基氮測(cè)定結(jié)果

圖5 游離氨基氮含量變化曲線

由圖5可知，4種乳酸菌在相同發(fā)酵條件下，甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料中游離氨基氮含量增減趨勢(shì)接近一致。在發(fā)酵前4 h，游離氨基氮含量均很大程度地降低，由開始發(fā)酵的4.88 ug/m L減小為1.67 ug/m L。在4～6 h，游離氨基氮含量又開始迅速上升，并于第6 h達(dá)到頂點(diǎn)，普遍增長(zhǎng)到4.20 ug/m L以上，其中L.plantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料游離氨基氮含量最高，達(dá)到4.62 ug/m L。之后，L.plantarum、L.actobacillus casei在6～8 h發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料中游離氨基氮含量基本趨于穩(wěn)定，分別保持在4.62 ug/m L，4.25 ug/m L，而L.rhamnosus、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料中游離氨基氮含量呈線性下降，直至發(fā)酵到12 h時(shí)，最終達(dá)到1.00 ug/m L左右。L.plantarum、L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料游離氨基氮含量在發(fā)酵8 h后呈線性下降，且L.plantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料中游離氨基氮含量在10 h后下降速率明顯減緩，穩(wěn)定在1.78 ug/m L水平；L.actobacillus casei發(fā)酵甜玉米乳清蛋白游離氨基氮含量也在10 h時(shí)開始減緩下降速度，在12 h時(shí)達(dá)到1.47 ug/m L。分析認(rèn)為，這種變化過程同樣是由于開始時(shí)，溶液中存量氨基酸被利用使得含量開始下降，之后隨著乳酸菌的大量生長(zhǎng)繁殖，開始分泌水解酶，繼而分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸，使氨基酸含量再次上升，而同時(shí)蛋白質(zhì)總量開始下降。隨著乳酸菌的繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，大量氨基酸被消耗利用，溶液中氨基酸含量持續(xù)下降。

2.6 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

表2 甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料的感官品評(píng)表（40人）

將發(fā)酵12 h后的L.plantarum、L.actobacillus casei、L.acidophilus和L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料，放入4℃冰箱中冷藏24 h，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，L.plantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料的品評(píng)得分最高為79.79分，L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料品評(píng)得分75.80最低。在狀態(tài)和色澤方面四種菌的差別都不大，而在口感和香氣方面有較明顯差別。感官品評(píng)結(jié)果顯示L.plantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料，酸甜適口，發(fā)酵香氣協(xié)調(diào)，而L.actobacillus casei，L.acidophilus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料酸甜失衡，發(fā)酵香味偏單一，酸味突出，風(fēng)味淡薄，L.rhamnosus酸味不足，口感差別跟發(fā)酵前相近，因此感官品評(píng)也最低。

3 結(jié)論

甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料發(fā)酵過程中，4種乳酸菌均表現(xiàn)為開始階段利用原料中的還原糖和游離氨基氮成分進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖并代謝乳酸，使p H值下降和可滴定酸度升高。但是，發(fā)酵能力差別較大。

同其他3種乳酸菌相比較，L.plantarum甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料pH值下降速率最快、幅度最大，發(fā)酵8 h后，p H值下降到4.30，經(jīng)感官評(píng)價(jià)酸味柔和協(xié)調(diào)，達(dá)到發(fā)酵飲料的適口水平，可作為甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料的發(fā)酵終點(diǎn)。pH值于發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定，顯示其后酸化能力較弱，利于保藏儲(chǔ)存。還原糖消耗速率較快，游離氨基氮、可溶性蛋白含量在6～8 h發(fā)酵過程中保持最高水平，此時(shí)飲料有很好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及協(xié)調(diào)而愉快的口感和風(fēng)味。

L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料pH值變化速率最慢，發(fā)酵12 h，p H值僅降低1.90，且游離氨基氮含量在發(fā)酵后期降低，所以其口感酸味不足，香氣較淡，說明其發(fā)酵甜玉米漿能力較差。

L.acidophilus發(fā)酵過程中pH值降低速率較快，酸發(fā)酵能力較強(qiáng)，缺點(diǎn)是還原糖、可溶性蛋白及游離氨基氮含量都明顯下降，營(yíng)養(yǎng)功能較差。L.actobacillus casei在發(fā)酵過程中不論在產(chǎn)酸速率，還是還原糖消耗速率，游離氨基氮含量變化都較平穩(wěn)，特點(diǎn)是可溶性蛋白含量在第8 h達(dá)到最大值，甚至超出甜玉米乳清蛋白飲料中的固有含量水平，游離氨基氮含量?jī)H次于L.plantarum發(fā)酵液水平，在營(yíng)養(yǎng)特性上有獨(dú)特作用，但感官評(píng)價(jià)略次于L.plantarum，因此也可以作為發(fā)酵甜玉米乳清蛋白飲料的極具潛力備選發(fā)酵菌種。

雖然L.plantarum在甜玉米乳清蛋白發(fā)酵飲料發(fā)酵過程中性能優(yōu)異，可以作為發(fā)酵甜玉米乳清蛋白的最佳發(fā)酵菌種，但是多菌種發(fā)酵體系更具有優(yōu)越性，這幾種乳酸菌的復(fù)合作用尚需進(jìn)一步研究。