吳永祥, 張 瑤，盧瑋瑋，胡曉倩，權(quán)泰亨，金泰完

( 1. 黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 安徽 黃山 245041; 2. 安東國(guó)立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，韓國(guó) 安東 760749 )

隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，全球肥胖率呈直線增長(zhǎng)趨勢(shì)，中國(guó)現(xiàn)已成為肥胖超級(jí)大國(guó)。肥胖是一種慢性疾病，可引發(fā)Ⅱ型糖尿病、血脂異常癥、心血管疾病和高血壓等疾病，嚴(yán)重危害公眾的身體健康[1]。脂肪細(xì)胞分化與調(diào)控的失常，可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞體積的增大、脂肪組織的沉積以及脂肪細(xì)胞調(diào)控因子分泌的紊亂，繼而引起肥胖代謝性疾病[2]。因此，研究脂肪細(xì)胞分化的抑制作用有助于尋找抗肥胖代謝性疾病的新原料，對(duì)于探索預(yù)防與治療代謝性疾病具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。蕨菜 (Pteridiumaquilinum(Linn.) Kuhn var. Latiusculum (Desv) Underw) 作為藥食兩用植物，有很高的藥用價(jià)值，有清熱解毒、消腫、利水、安神、潤(rùn)腸通便等功效，可用于治療高血壓、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥狀[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明：蕨菜含有多酚、多糖、黃酮、萜類(lèi)等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫等功效[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，不同真菌固體發(fā)酵前后蕨菜醇提取物具有明顯體外抗氧化和抗炎癥活性。蕨菜水提取物對(duì)高血脂小鼠的血脂代謝紊亂具有良好調(diào)節(jié)作用[6]，但蕨菜超臨界萃取物對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的抑制作用及其分子機(jī)制尚不明確。

超臨界CO2萃取是一種低溫綠色環(huán)保萃取分離技術(shù)，與溶劑提取法、酶解輔助法和超聲提取法等傳統(tǒng)工藝相比，具有萃取高效、時(shí)間短、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，且更大程度上保留了天然植物熱敏性和易氧化等生物活性成分。顧仁勇等[7]采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取八月瓜多酚，多酚含量提高2.45倍，產(chǎn)品純度提高15.46%。Tohar等[8]采用超臨界CO2萃取美麗帽柱木葉的活性成分，明顯增加了其抗炎癥作用。然而，目前尚鮮有關(guān)于蕨菜超臨界萃取及其化學(xué)成分的研究。為此，本研究采用超臨界CO2技術(shù)萃取蕨菜活性成分，通過(guò)GC-MS對(duì)萃取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，并探究蕨菜萃取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用及分子機(jī)制，以期為蕨菜進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.2 藥品與試劑四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT；批號(hào)：M2128，規(guī)格：1 g)、胰島素(insulin；批號(hào)：I9278，規(guī)格：5 mL)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-l-methylxanthine，IBMX；批號(hào)：17018，規(guī)格：100 mg)、地塞米松(dexamethasone，Dex；批號(hào)：D4902，規(guī)格：100 mg)、油紅 O(批號(hào)：O0625，規(guī)格：25 g)，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：88425，規(guī)格：135 g)、胰蛋白酶(批號(hào)：A40009，規(guī)格：100 μg)、胎牛血清(批號(hào)：26400044，規(guī)格：500 mL)、小牛血清(批號(hào)：16010159，規(guī)格：500 mL)及其它細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；cDNA合成試劑盒(批號(hào)：6110B，規(guī)格：200 rxns)購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 儀器Waters MV-10型超臨界萃取系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；Agilent HP7890-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；SpectraMax-190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；IX51型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ECOTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Illumina公司)。

2 方法

2.1 蕨菜超臨界萃取物的制備將蕨菜洗凈晾干，于60 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)40目篩，得蕨菜粉末。準(zhǔn)確稱(chēng)取原料5.0 g，采用超臨界CO2流體萃取方法提取蕨菜活性成分。萃取條件為：萃取壓力20 Mpa，溫度30 ℃，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間10 min，靜態(tài)萃取時(shí)間10 min，CO2流量10 mL·min-1，夾帶劑為75%乙醇1 mL·min-1，循環(huán)萃取2次。萃取后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至恒重，得到粘稠狀萃取物。

2.2 蕨菜萃取物化學(xué)成分的GC-MS分析將超臨界萃取得到的蕨菜萃取物用甲醇配制成1 000 mg·L-1溶液，利用GC-MS對(duì)試樣進(jìn)行分析。色譜條件：選用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量為0.5 μL，進(jìn)樣口模式為不分流，進(jìn)樣口溫度為280 ℃；柱箱程序?yàn)?0 ℃保持3 min，以4 ℃·min-1升至160 ℃保持3 min，以4 ℃·min-1升至285 ℃保持10 min；運(yùn)行時(shí)間為 70 min。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃；掃描范圍m/z為35～450 amu全離子掃描；質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)。

2.3 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化將3T3-L1前脂肪細(xì)胞置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，以1×108·L-1細(xì)胞密度接種于24孔板中，每孔加入500 μL細(xì)胞懸浮液。待細(xì)胞融合后接觸抑制48 h(記為分化d 0)，加含0.5 mmol·L-1IBMX、5 mg·L-1胰島素、1 μmol·L-1Dex及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h(d 2)，更換為含5 mg·L-1胰島素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h(d 4)。以后每48 h更換一次10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，直至90%的前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，并于d 8檢測(cè)脂肪的含量[2]。在0～8天中，同時(shí)加入不同濃度的蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞為對(duì)照組(Control)、誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞為模型組(Model)、SFE-PA組(誘導(dǎo)分化+ SFE-PA 50、100、200 mg·L-1)。每組平行3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.4 MTT法檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，以1×108·L-1細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL。待細(xì)胞完全貼壁良好后(約48 h)，更換含不同濃度蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h, 然后去除孔內(nèi)的液體，每孔中加入200 μL DMSO 使紫色結(jié)晶充分溶解，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的OD值[9]。

2.5 油紅O染色比色法分析3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化程度誘導(dǎo)分化d 8，移去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，然后用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，加入油紅O染液。染色60 min后去除染液，PBS清洗3次，倒置顯微鏡下觀察并拍攝照片，之后加入200 μL異丙醇使其充分溶解染色脂肪細(xì)胞內(nèi)的油紅O，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值[2]。

2.6 qRT-PCR法檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和脂質(zhì)合成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)采用不同濃度蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)處理3T3-L1細(xì)胞，利用TRIzol試劑提取總RNA，然后采用PrimeScriptTMRT試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入SYBR Green、引物及cDNA模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for targeted mouse genes

3 結(jié)果

3.1 蕨菜超臨界萃取物的化學(xué)成分分析對(duì)蕨菜超臨界萃取物的主要化學(xué)成分進(jìn)行了GC-MS定性分析，總離子流圖譜如Fig 1所示。運(yùn)用NIST08質(zhì)譜庫(kù)對(duì)照，從SFE-PA中鑒定出10種化合物，占總峰面積量的87.17%。由Tab 2可知，SFE-PA含有酚類(lèi)、酯類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、醇類(lèi)等化合物，以酚類(lèi)、醇類(lèi)化合物為主，其中含有2種酚類(lèi)化合物(44.33%)、4種醇類(lèi)化合物(32.08%)、2種有機(jī)酸類(lèi)化合物(9.46%)、2種酯類(lèi)化合物(1.30%)。SFE-PA的主要化學(xué)成分為4,4,5,7,8-五甲基-二氫香豆素(36.07%)、β-谷甾醇(25.66%)、4-氨基-7-二乙氨基-香豆素(8.26%)、棕櫚酸(5.05%)、亞油酸(4.41%)、植醇(3.31%)、菜油甾醇(2.06%)等。

Fig 1 Total ion chromatogram of supercritical extract from Pteridium aquilinum

Tab 2 Chemical constituents and relative contents of supercritical extract from Pteridium aquilinum

3.2 SFE-PA對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性的影響由Fig 2可知，在50 ～ 200 mg·L-1濃度下，蕨菜超臨界萃取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，且無(wú)劑量效應(yīng)。當(dāng)濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí)，3T3-L1前脂肪細(xì)胞活力為99.39%，與空白對(duì)照組相比(Control)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上說(shuō)明，SFE-PA在200 mg·L-1濃度內(nèi)，對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。

Fig 2 Effect of SFE-PA on cell viability of 3T3-L1 preadipocytes n=3)

3.3 SFE-PA對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響由Fig 3可知，蕨菜超臨界萃取物可以明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，明顯減少成熟脂肪細(xì)胞中的脂肪積累。采用油紅O染色比色進(jìn)行分析，SFE-PA在濃度50、100、200 mg·L-1處理?xiàng)l件下，其脂肪含量分別是模型組(Model)的86.73%、64.01%、48.54%，呈劑量依賴(lài)性降低，且差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 Effect of SFE-PA on differentiation of

##P<0.01vscontrol group，**P<0.01vsmodel group

Fig 4 Morphological micrographs of 3T3-L1 preadipocytes after incubation with SFE-PA (×200)

a: Control; b: Model; c: SFE-PA 50 mg·L-1; d: SFE-PA 100 mg·L-1; e: SFE-PA 200 mg·L-1.

3.4 SFE-PA對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化前后形態(tài)學(xué)的影響Fig 4所示為3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化前后的形態(tài)變化，在顯微鏡下觀察，未誘導(dǎo)分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂滴。采用雞尾酒式誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞形態(tài)變大變圓，體積增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂滴，8 d后90%以上的細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。通過(guò)油紅O染色，可見(jiàn)胞質(zhì)中含有的大量脂滴被染成紅色，在核周?chē)纬伞敖渲腑h(huán)”結(jié)構(gòu)。經(jīng)蕨菜超臨界萃取物干預(yù)后，脂肪細(xì)胞中被染成紅色的脂滴減少，且呈劑量效應(yīng)。

3.5 SFE-PA對(duì)脂肪細(xì)胞分化中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ，CEBPα，SREBP-1c mRNA表達(dá)影響過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)是3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。由Fig 5可知，與對(duì)照組(Control)相比，隨著脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的進(jìn)行，模型組PPARγ和CEBPα的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。

Fig 5 Effect of SFE-PA on mRNA expression of PPARγ, CEBPα, SREBP-1c in adipocytes n=3)

##P<0.01vscontrol group,*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

SFE-PA可以明顯下調(diào)PPARγ和CEBPα mRNA表達(dá)量，其中200 mg·L-1SFE-PA處理組分別下降為模型組(Model)的18.21%和15.54%，差異有顯著性(P<0.01)。SFE-PA還明顯降低了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1c, SREBP-1c)mRNA表達(dá)水平，其中100、200 mg·L-1SFE-PA處理組分別下降為模型組(Model)的52.65%、27.16%，呈劑量依賴(lài)性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.6 SFE-PA對(duì)脂肪細(xì)胞分化中脂質(zhì)合成相關(guān)基因FAS，ACC mRNA表達(dá)的影響乙酰輔酶A 羧化酶 (acetyl CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)是脂質(zhì)合成途徑中關(guān)鍵酶，在脂肪沉積中發(fā)揮了重要作用。由Fig 6可知，與對(duì)照組(Control)相比，隨著脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的進(jìn)行，模型組(Model)FAS和ACC的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，分別是對(duì)照組的15.76、5.35倍。SFE-PA明顯抑制了脂肪細(xì)胞分化中脂質(zhì)合成基因FAS、ACC mRNA的表達(dá)水平，隨著SFE-PA濃度的增加，抑制效果呈濃度依賴(lài)性增加，差異且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組(Model)相比，當(dāng)SFE-PA濃度為200 mg·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)FAS、ACC mRNA表達(dá)的抑制率分別96.54%、90.11%。

Fig 6 Effect of SFE-PA on mRNA expression of FAS, ACC in adipocytes n=3)

##P<0.01vscontrol group,**P<0.01vsmodel group

4 討論

肥胖作為一種慢性代謝性疾病已成為危害全球公眾健康的主要問(wèn)題之一，它與血脂異常癥、心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。治療肥胖的藥物主要有奧利司他(orlistat)和西布曲明(sibutramine)，但長(zhǎng)期服用效果不理想，而且存在嚴(yán)重的副作用，如頭疼、胃疼、腹瀉等，甚至可能增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，因此，人們急需一種安全并高效的治療藥物[10]。酚類(lèi)、黃酮、多糖、醇類(lèi)等生物活性物質(zhì)是近年來(lái)各領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，大多數(shù)體外研究表明[2,4,10]，天然植物資源來(lái)源的酚類(lèi)、黃酮、多糖等具有抗氧化、抗肥胖、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫等生物學(xué)作用。本研究采用超臨界CO2萃取蕨菜活性物質(zhì)，通過(guò)GC-MS分析其主要化學(xué)成分，并以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，研究蕨菜超臨界萃取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響，探討蕨菜在抗肥胖代謝性疾病方面的功效。共鑒定出10種化合物，占總峰面積量的87.17%，主要化學(xué)成分為4,4,5,7,8-五甲基-二氫香豆素(36.07%)、β-谷甾醇(25.66%)、4-氨基-7-二乙氨基-香豆素(8.26%)等。姚元發(fā)[11]研究表明，香豆素類(lèi)化合物能改善高脂小鼠的血脂水平，并明顯減輕肥胖小鼠體重。Yang等[12]從魯桑中分離鑒定出β-谷甾醇等活性成分，并發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能明顯抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化。從本試驗(yàn)中我們得出蕨菜超臨界萃取物顯著性的抑制脂肪細(xì)胞的分化，而高含量的酚類(lèi)、醇類(lèi)可能是其潛在的抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

為了闡明其中的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。目前研究認(rèn)為調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)控因子包括PPARγ、CEBPα和SREBP-1c。PPARγ和CEBPα具有調(diào)節(jié)脂肪形成、糖脂代謝和細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)功能，它們的過(guò)度表達(dá)可以誘導(dǎo)并加快脂肪細(xì)胞分化，并激活眾多脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂肪的累積[13]。SREBP-1c在前脂肪細(xì)胞分化早期發(fā)揮著重要作用，并能夠在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中增加PPARγ的活性[14]。本研究中，蕨菜超臨界萃取物可以明顯抑制脂肪細(xì)胞中PPARγ、CEBPα和SREBP-1c的mRNA表達(dá)，從而一定程度上抑制了前脂肪細(xì)胞的分化，減少成熟脂肪細(xì)胞中的脂肪積累。研究表明脂肪細(xì)胞分化也與脂質(zhì)合成酶基因密切相關(guān)。FAS和ACC是脂質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶，在脂肪沉積中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)脂肪細(xì)胞分化時(shí)，脂滴增多，即FAS和ACC表達(dá)增加[15]。本研究結(jié)果表明，蕨菜超臨界萃取物在mRNA水平對(duì)FAS和ACC表達(dá)下調(diào)明顯，從而明顯減少了細(xì)胞內(nèi)三酰甘油脂滴生成。

綜上所述，蕨菜超臨界萃取物能夠明顯抑制3T3-L1細(xì)胞分化，減少細(xì)胞脂肪沉積，可能是通過(guò)減少脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ、CEBPα和SREBP-1c的mRNA表達(dá)量，下調(diào)脂質(zhì)合成相關(guān)基因FAS和ACC的mRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)GC-MS分析萃取物中的主要化學(xué)成分，共鑒定出10種化合物，其中高含量的酚類(lèi)、醇類(lèi)可能是其潛在的抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究揭示了蕨菜在肥胖的預(yù)防治療中具有潛在的價(jià)值。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在安徽省黃山學(xué)院生態(tài)與健康技術(shù)中心和韓國(guó)安東國(guó)立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝胡長(zhǎng)玉老師、耿玉闖、武夢(mèng)雪、王雅莉等同學(xué)的幫助，在此致以真誠(chéng)的感謝。)