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        蕨菜超臨界萃取物化學(xué)成分及其抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化作用研究

        2019-11-07 01:05:44吳永祥盧瑋瑋胡曉倩權(quán)泰亨金泰完
        中國(guó)藥理學(xué)通報(bào) 2019年11期

        吳永祥, 張 瑤,盧瑋瑋,胡曉倩,權(quán)泰亨,金泰完

        ( 1. 黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 安徽 黃山 245041; 2. 安東國(guó)立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,韓國(guó) 安東 760749 )

        隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高,全球肥胖率呈直線增長(zhǎng)趨勢(shì),中國(guó)現(xiàn)已成為肥胖超級(jí)大國(guó)。肥胖是一種慢性疾病,可引發(fā)Ⅱ型糖尿病、血脂異常癥、心血管疾病和高血壓等疾病,嚴(yán)重危害公眾的身體健康[1]。脂肪細(xì)胞分化與調(diào)控的失常,可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞體積的增大、脂肪組織的沉積以及脂肪細(xì)胞調(diào)控因子分泌的紊亂,繼而引起肥胖代謝性疾病[2]。因此,研究脂肪細(xì)胞分化的抑制作用有助于尋找抗肥胖代謝性疾病的新原料,對(duì)于探索預(yù)防與治療代謝性疾病具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。蕨菜 (Pteridiumaquilinum(Linn.) Kuhn var. Latiusculum (Desv) Underw) 作為藥食兩用植物,有很高的藥用價(jià)值,有清熱解毒、消腫、利水、安神、潤(rùn)腸通便等功效,可用于治療高血壓、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥狀[3]?,F(xiàn)代藥理研究表明:蕨菜含有多酚、多糖、黃酮、萜類(lèi)等多種生物活性物質(zhì),具有抗氧化、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫等功效[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5],不同真菌固體發(fā)酵前后蕨菜醇提取物具有明顯體外抗氧化和抗炎癥活性。蕨菜水提取物對(duì)高血脂小鼠的血脂代謝紊亂具有良好調(diào)節(jié)作用[6],但蕨菜超臨界萃取物對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的抑制作用及其分子機(jī)制尚不明確。

        超臨界CO2萃取是一種低溫綠色環(huán)保萃取分離技術(shù),與溶劑提取法、酶解輔助法和超聲提取法等傳統(tǒng)工藝相比,具有萃取高效、時(shí)間短、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn),且更大程度上保留了天然植物熱敏性和易氧化等生物活性成分。顧仁勇等[7]采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取八月瓜多酚,多酚含量提高2.45倍,產(chǎn)品純度提高15.46%。Tohar等[8]采用超臨界CO2萃取美麗帽柱木葉的活性成分,明顯增加了其抗炎癥作用。然而,目前尚鮮有關(guān)于蕨菜超臨界萃取及其化學(xué)成分的研究。為此,本研究采用超臨界CO2技術(shù)萃取蕨菜活性成分,通過(guò)GC-MS對(duì)萃取物進(jìn)行化學(xué)成分分析,并探究蕨菜萃取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用及分子機(jī)制,以期為蕨菜進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料

        1.1 細(xì)胞株3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection, ATCC)。

        1.2 藥品與試劑四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT;批號(hào):M2128,規(guī)格:1 g)、胰島素(insulin;批號(hào):I9278,規(guī)格:5 mL)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-l-methylxanthine,IBMX;批號(hào):17018,規(guī)格:100 mg)、地塞米松(dexamethasone,Dex;批號(hào):D4902,規(guī)格:100 mg)、油紅 O(批號(hào):O0625,規(guī)格:25 g),均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):88425,規(guī)格:135 g)、胰蛋白酶(批號(hào):A40009,規(guī)格:100 μg)、胎牛血清(批號(hào):26400044,規(guī)格:500 mL)、小牛血清(批號(hào):16010159,規(guī)格:500 mL)及其它細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;cDNA合成試劑盒(批號(hào):6110B,規(guī)格:200 rxns)購(gòu)自日本TaKaRa公司。

        1.3 儀器Waters MV-10型超臨界萃取系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司);Agilent HP7890-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司);SpectraMax-190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);IX51型倒置顯微鏡(日本Olympus公司);ECOTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Illumina公司)。

        2 方法

        2.1 蕨菜超臨界萃取物的制備將蕨菜洗凈晾干,于60 ℃烘干至恒重,粉碎過(guò)40目篩,得蕨菜粉末。準(zhǔn)確稱(chēng)取原料5.0 g,采用超臨界CO2流體萃取方法提取蕨菜活性成分。萃取條件為:萃取壓力20 Mpa,溫度30 ℃,動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間10 min,靜態(tài)萃取時(shí)間10 min,CO2流量10 mL·min-1,夾帶劑為75%乙醇1 mL·min-1,循環(huán)萃取2次。萃取后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至恒重,得到粘稠狀萃取物。

        2.2 蕨菜萃取物化學(xué)成分的GC-MS分析將超臨界萃取得到的蕨菜萃取物用甲醇配制成1 000 mg·L-1溶液,利用GC-MS對(duì)試樣進(jìn)行分析。色譜條件:選用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣量為0.5 μL,進(jìn)樣口模式為不分流,進(jìn)樣口溫度為280 ℃;柱箱程序?yàn)?0 ℃保持3 min,以4 ℃·min-1升至160 ℃保持3 min,以4 ℃·min-1升至285 ℃保持10 min;運(yùn)行時(shí)間為 70 min。質(zhì)譜條件:電離方式為電子轟擊(EI),電子能量為70 eV,離子源溫度為230 ℃;掃描范圍m/z為35~450 amu全離子掃描;質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)。

        2.3 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化將3T3-L1前脂肪細(xì)胞置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí),傳代培養(yǎng)。

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1前脂肪細(xì)胞,以1×108·L-1細(xì)胞密度接種于24孔板中,每孔加入500 μL細(xì)胞懸浮液。待細(xì)胞融合后接觸抑制48 h(記為分化d 0),加含0.5 mmol·L-1IBMX、5 mg·L-1胰島素、1 μmol·L-1Dex及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h(d 2),更換為含5 mg·L-1胰島素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h(d 4)。以后每48 h更換一次10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,直至90%的前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞,并于d 8檢測(cè)脂肪的含量[2]。在0~8天中,同時(shí)加入不同濃度的蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞為對(duì)照組(Control)、誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞為模型組(Model)、SFE-PA組(誘導(dǎo)分化+ SFE-PA 50、100、200 mg·L-1)。每組平行3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。

        2.4 MTT法檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1前脂肪細(xì)胞,以1×108·L-1細(xì)胞密度接種于96孔板中,每孔加入100 μL。待細(xì)胞完全貼壁良好后(約48 h),更換含不同濃度蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后,每孔加入MTT溶液 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)3 h, 然后去除孔內(nèi)的液體,每孔中加入200 μL DMSO 使紫色結(jié)晶充分溶解,于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的OD值[9]。

        2.5 油紅O染色比色法分析3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化程度誘導(dǎo)分化d 8,移去培養(yǎng)液,用PBS清洗3次,然后用4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗3次,加入油紅O染液。染色60 min后去除染液,PBS清洗3次,倒置顯微鏡下觀察并拍攝照片,之后加入200 μL異丙醇使其充分溶解染色脂肪細(xì)胞內(nèi)的油紅O,于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值[2]。

        2.6 qRT-PCR法檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和脂質(zhì)合成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)采用不同濃度蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)處理3T3-L1細(xì)胞,利用TRIzol試劑提取總RNA,然后采用PrimeScriptTMRT試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入SYBR Green、引物及cDNA模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表Tab 1。

        Tab 1 Primer sequences for targeted mouse genes

        3 結(jié)果

        3.1 蕨菜超臨界萃取物的化學(xué)成分分析對(duì)蕨菜超臨界萃取物的主要化學(xué)成分進(jìn)行了GC-MS定性分析,總離子流圖譜如Fig 1所示。運(yùn)用NIST08質(zhì)譜庫(kù)對(duì)照,從SFE-PA中鑒定出10種化合物,占總峰面積量的87.17%。由Tab 2可知,SFE-PA含有酚類(lèi)、酯類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、醇類(lèi)等化合物,以酚類(lèi)、醇類(lèi)化合物為主,其中含有2種酚類(lèi)化合物(44.33%)、4種醇類(lèi)化合物(32.08%)、2種有機(jī)酸類(lèi)化合物(9.46%)、2種酯類(lèi)化合物(1.30%)。SFE-PA的主要化學(xué)成分為4,4,5,7,8-五甲基-二氫香豆素(36.07%)、β-谷甾醇(25.66%)、4-氨基-7-二乙氨基-香豆素(8.26%)、棕櫚酸(5.05%)、亞油酸(4.41%)、植醇(3.31%)、菜油甾醇(2.06%)等。

        Fig 1 Total ion chromatogram of supercritical extract from Pteridium aquilinum

        Tab 2 Chemical constituents and relative contents of supercritical extract from Pteridium aquilinum

        3.2 SFE-PA對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性的影響由Fig 2可知,在50 ~ 200 mg·L-1濃度下,蕨菜超臨界萃取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性無(wú)明顯影響,且無(wú)劑量效應(yīng)。當(dāng)濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí),3T3-L1前脂肪細(xì)胞活力為99.39%,與空白對(duì)照組相比(Control),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上說(shuō)明,SFE-PA在200 mg·L-1濃度內(nèi),對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。

        Fig 2 Effect of SFE-PA on cell viability of 3T3-L1 preadipocytes n=3)

        3.3 SFE-PA對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響由Fig 3可知,蕨菜超臨界萃取物可以明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化,明顯減少成熟脂肪細(xì)胞中的脂肪積累。采用油紅O染色比色進(jìn)行分析,SFE-PA在濃度50、100、200 mg·L-1處理?xiàng)l件下,其脂肪含量分別是模型組(Model)的86.73%、64.01%、48.54%,呈劑量依賴(lài)性降低,且差異具有顯著性(P<0.01)。

        Fig 3 Effect of SFE-PA on differentiation of

        ##P<0.01vscontrol group,**P<0.01vsmodel group

        Fig 4 Morphological micrographs of 3T3-L1 preadipocytes after incubation with SFE-PA (×200)

        a: Control; b: Model; c: SFE-PA 50 mg·L-1; d: SFE-PA 100 mg·L-1; e: SFE-PA 200 mg·L-1.

        3.4 SFE-PA對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化前后形態(tài)學(xué)的影響Fig 4所示為3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化前后的形態(tài)變化,在顯微鏡下觀察,未誘導(dǎo)分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞為長(zhǎng)梭形,細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂滴。采用雞尾酒式誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞形態(tài)變大變圓,體積增大,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂滴,8 d后90%以上的細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。通過(guò)油紅O染色,可見(jiàn)胞質(zhì)中含有的大量脂滴被染成紅色,在核周?chē)纬伞敖渲腑h(huán)”結(jié)構(gòu)。經(jīng)蕨菜超臨界萃取物干預(yù)后,脂肪細(xì)胞中被染成紅色的脂滴減少,且呈劑量效應(yīng)。

        3.5 SFE-PA對(duì)脂肪細(xì)胞分化中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ,CEBPα,SREBP-1c mRNA表達(dá)影響過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα)是3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。由Fig 5可知,與對(duì)照組(Control)相比,隨著脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的進(jìn)行,模型組PPARγ和CEBPα的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。

        Fig 5 Effect of SFE-PA on mRNA expression of PPARγ, CEBPα, SREBP-1c in adipocytes n=3)

        ##P<0.01vscontrol group,*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

        SFE-PA可以明顯下調(diào)PPARγ和CEBPα mRNA表達(dá)量,其中200 mg·L-1SFE-PA處理組分別下降為模型組(Model)的18.21%和15.54%,差異有顯著性(P<0.01)。SFE-PA還明顯降低了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1c, SREBP-1c)mRNA表達(dá)水平,其中100、200 mg·L-1SFE-PA處理組分別下降為模型組(Model)的52.65%、27.16%,呈劑量依賴(lài)性降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

        3.6 SFE-PA對(duì)脂肪細(xì)胞分化中脂質(zhì)合成相關(guān)基因FAS,ACC mRNA表達(dá)的影響乙酰輔酶A 羧化酶 (acetyl CoA carboxylase,ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,F(xiàn)AS)是脂質(zhì)合成途徑中關(guān)鍵酶,在脂肪沉積中發(fā)揮了重要作用。由Fig 6可知,與對(duì)照組(Control)相比,隨著脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的進(jìn)行,模型組(Model)FAS和ACC的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01),分別是對(duì)照組的15.76、5.35倍。SFE-PA明顯抑制了脂肪細(xì)胞分化中脂質(zhì)合成基因FAS、ACC mRNA的表達(dá)水平,隨著SFE-PA濃度的增加,抑制效果呈濃度依賴(lài)性增加,差異且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組(Model)相比,當(dāng)SFE-PA濃度為200 mg·L-1時(shí),對(duì)細(xì)胞內(nèi)FAS、ACC mRNA表達(dá)的抑制率分別96.54%、90.11%。

        Fig 6 Effect of SFE-PA on mRNA expression of FAS, ACC in adipocytes n=3)

        ##P<0.01vscontrol group,**P<0.01vsmodel group

        4 討論

        肥胖作為一種慢性代謝性疾病已成為危害全球公眾健康的主要問(wèn)題之一,它與血脂異常癥、心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。治療肥胖的藥物主要有奧利司他(orlistat)和西布曲明(sibutramine),但長(zhǎng)期服用效果不理想,而且存在嚴(yán)重的副作用,如頭疼、胃疼、腹瀉等,甚至可能增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),因此,人們急需一種安全并高效的治療藥物[10]。酚類(lèi)、黃酮、多糖、醇類(lèi)等生物活性物質(zhì)是近年來(lái)各領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),大多數(shù)體外研究表明[2,4,10],天然植物資源來(lái)源的酚類(lèi)、黃酮、多糖等具有抗氧化、抗肥胖、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫等生物學(xué)作用。本研究采用超臨界CO2萃取蕨菜活性物質(zhì),通過(guò)GC-MS分析其主要化學(xué)成分,并以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象,研究蕨菜超臨界萃取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響,探討蕨菜在抗肥胖代謝性疾病方面的功效。共鑒定出10種化合物,占總峰面積量的87.17%,主要化學(xué)成分為4,4,5,7,8-五甲基-二氫香豆素(36.07%)、β-谷甾醇(25.66%)、4-氨基-7-二乙氨基-香豆素(8.26%)等。姚元發(fā)[11]研究表明,香豆素類(lèi)化合物能改善高脂小鼠的血脂水平,并明顯減輕肥胖小鼠體重。Yang等[12]從魯桑中分離鑒定出β-谷甾醇等活性成分,并發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能明顯抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化。從本試驗(yàn)中我們得出蕨菜超臨界萃取物顯著性的抑制脂肪細(xì)胞的分化,而高含量的酚類(lèi)、醇類(lèi)可能是其潛在的抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

        為了闡明其中的分子機(jī)制,本研究檢測(cè)了脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。目前研究認(rèn)為調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)控因子包括PPARγ、CEBPα和SREBP-1c。PPARγ和CEBPα具有調(diào)節(jié)脂肪形成、糖脂代謝和細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)功能,它們的過(guò)度表達(dá)可以誘導(dǎo)并加快脂肪細(xì)胞分化,并激活眾多脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂肪的累積[13]。SREBP-1c在前脂肪細(xì)胞分化早期發(fā)揮著重要作用,并能夠在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中增加PPARγ的活性[14]。本研究中,蕨菜超臨界萃取物可以明顯抑制脂肪細(xì)胞中PPARγ、CEBPα和SREBP-1c的mRNA表達(dá),從而一定程度上抑制了前脂肪細(xì)胞的分化,減少成熟脂肪細(xì)胞中的脂肪積累。研究表明脂肪細(xì)胞分化也與脂質(zhì)合成酶基因密切相關(guān)。FAS和ACC是脂質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶,在脂肪沉積中發(fā)揮著重要作用,當(dāng)脂肪細(xì)胞分化時(shí),脂滴增多,即FAS和ACC表達(dá)增加[15]。本研究結(jié)果表明,蕨菜超臨界萃取物在mRNA水平對(duì)FAS和ACC表達(dá)下調(diào)明顯,從而明顯減少了細(xì)胞內(nèi)三酰甘油脂滴生成。

        綜上所述,蕨菜超臨界萃取物能夠明顯抑制3T3-L1細(xì)胞分化,減少細(xì)胞脂肪沉積,可能是通過(guò)減少脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ、CEBPα和SREBP-1c的mRNA表達(dá)量,下調(diào)脂質(zhì)合成相關(guān)基因FAS和ACC的mRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)GC-MS分析萃取物中的主要化學(xué)成分,共鑒定出10種化合物,其中高含量的酚類(lèi)、醇類(lèi)可能是其潛在的抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究揭示了蕨菜在肥胖的預(yù)防治療中具有潛在的價(jià)值。

        (致謝:本實(shí)驗(yàn)主要在安徽省黃山學(xué)院生態(tài)與健康技術(shù)中心和韓國(guó)安東國(guó)立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成,感謝胡長(zhǎng)玉老師、耿玉闖、武夢(mèng)雪、王雅莉等同學(xué)的幫助,在此致以真誠(chéng)的感謝。)

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