馬冬雪，董賢慧，賀小平，許力軍，劉亞磊，高維娟

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年癡呆的主要原因，是以進(jìn)行性癡呆為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力衰退，性格和行為改變，判斷力下降，生活自理能力喪失。AD是一種多病因介導(dǎo)的疾病，其發(fā)病機(jī)制學(xué)說有很多，目前仍不明確。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的腦鐵水平異常升高[1-2]，異常增高的腦鐵啟動機(jī)體級聯(lián)放大機(jī)制，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)可以應(yīng)用去鐵劑來改善患者的臨床癥狀及生活自理能力[4]，但因其毒副作用強(qiáng)、口服效果差等缺點(diǎn)限制了臨床應(yīng)用[5]。

鐵調(diào)素(hepcidin)是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的鐵調(diào)節(jié)激素，能夠精確調(diào)控鐵的吸收、儲存和釋放過程。因此，檢測海馬區(qū)hepcidin的表達(dá)水平對探討藥物治療療效有一定的意義。

中醫(yī)認(rèn)為AD發(fā)病以腎虛精虧，氣血不足為本，痰瘀互結(jié)，濁毒內(nèi)生為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證。根據(jù)中醫(yī)“標(biāo)本兼治”的治療原則，治療AD應(yīng)補(bǔ)腎健脾，益氣養(yǎng)血以培其本，化痰、祛瘀、解毒以治其標(biāo)。因此，我們課題組以APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠為動物模型，將淫羊霍、黃芪、葛根素活性成分組方，采用免疫熒光、Real-time PCR、Western blot的實(shí)驗(yàn)方法分析淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬CA3區(qū)hepcidin表達(dá)的影響，以期為AD的治療提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組10月齡雄性APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠30只，體質(zhì)量(26±4)g，分別為復(fù)方組、模型組和DFX組，每組10只。10月齡雄性C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組。APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因模型小組許可證號為SCXK(魯)2016-0001，由山東斯科貝斯生物科技股份有限公司提供。C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，單籠喂養(yǎng)動物飼料及飲水，保持12 h的明暗周期，室溫25 ℃，濕度50%。

1.2 主要藥品和試劑南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供的黃芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素；大連美侖生物技術(shù)有限公司的DFX；hepcidin兔多克隆抗體NBP1-59337：novus公司；Anti -beta actin rabbit polyclonalGB11001：武漢賽維爾生物科技有限公司；江蘇碧云天公司的Western一抗稀釋液P0023A；Thermo Scientific的蛋白Marker #26616；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG GB23303：武漢賽維爾生物科技有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus) RR820A：TaKaRa公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time) RR047A:TaKaRa公司；Hepcidin25 BS8870R：博奧森生物有限公司。

1.3 儀器DM5000B型光學(xué)顯微鏡、EG11508型組織包埋機(jī)、RM2255型全自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)均購于Leica公司；實(shí)時熒光定量PCR儀CFX Connectgou型、蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移儀購于美國Biorad；制冰機(jī)BF320AS型購于意大利斯科茨曼公司；多功能成像系統(tǒng)Fusion FX5 Spectra型購自于法國Vilber。

1.4 給藥方案實(shí)驗(yàn)動物從10月齡開始用藥，給藥1個月至小鼠11月齡。以黃芪、淫羊藿、葛根有效組分復(fù)方給予復(fù)方組小鼠灌胃，黃芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素的臨床用量分別為80 mg·kg-1、120 mg·kg-1和80 mg·kg-1。正常對照組和模型組小鼠以等量生理鹽水灌胃，DFX組以DFX灌胃，劑量為100 mg·kg-1。所有動物每次灌胃藥液的量均以0.1 ml/10 g計(jì)，每日1次。

1.5 取材每組取3只小鼠麻醉后斷頭取腦。然后用4%多聚甲醛體外固定24 h，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，免疫熒光染色。各組剩余的7只小鼠斷頭取腦后取小鼠海馬組織，將海馬組織分為左側(cè)和右側(cè)兩部分，其中左側(cè)海馬組織用來做Real-time PCR檢測，右側(cè)海馬組織用來做Western blot檢測。

1.6 免疫熒光檢測小鼠海馬CA3區(qū)hepcidin蛋白的表達(dá)在切片上滴加PBS按照1 ∶50稀釋的一抗，4 ℃的濕盒內(nèi)過夜。將處理好的切片放入pH 7.4的PBS中充分漂洗后，以1 ∶300比例加入山羊抗兔二抗并于室溫下培養(yǎng)50 min。漂洗后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于TG全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)觀察海馬CA3區(qū)hepcidin蛋白的表達(dá)情況。

1.7 Western blot檢測小鼠海馬CA3區(qū)hepcidin蛋白的表達(dá)提取各組小鼠海馬區(qū)蛋白，BCA蛋白定量。各組上樣量為40 μg，電泳。轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上，5%牛奶封閉2 h，兔抗β-actin，兔抗hepcidin 4 ℃孵育過夜，洗膜。滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，洗膜。采用ImageJ軟件分析測量灰度值。

1.8 Real-time PCR檢測小鼠海馬CA3區(qū)hepcidin mRNA的表達(dá)試劑盒提取各組RNA，A260/A280進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測，以吸光度值為基礎(chǔ)進(jìn)行RNA濃度檢測。按照PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)取1μg的總RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，目的基因hepcidin引物(上游：5′-AGCAGCACCACCTATCTCCA-3′，下游：5′-TATC GCAATGTCTGCCCTGC-3′)，內(nèi)參基因β-actin引物(上游:5′-ACAGCTTCTTTGCAGCTCCTTC-3′，下游：5′-CCACGATGGAGGGGAATACAG-3′)，應(yīng)用TaKaRa公司TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)進(jìn)行以下操作；以5倍梯度稀釋5個濃度的cDNA樣本，確定目的基因與β-actin基因擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定擴(kuò)增效率。上下游各取0.8 μL引物，取12.5 μL TB Green Premix Ex TaqⅡ (TliRNaseH Plus)(2×)，1 μLPCR Reverse Primer (10 μmol·L-1)和PCR Forward Primer (10 μmol·L-1)，另取8.5μL滅菌用水和2 μL DNA模板(<100 ng)，反應(yīng)物總體積25 μL，于Real time PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。待測樣品的目的基因表達(dá)相對數(shù)量用2-△△CT表示。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光結(jié)果應(yīng)用免疫熒光單標(biāo)和TG全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)觀察小鼠海馬CA3區(qū)hepcidin陽性表達(dá)水平，hepcidin蛋白陽性表達(dá)為綠色。Fig 1結(jié)果顯示，APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬CA3區(qū)hepcidin陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05)，淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方和DFX灌胃干預(yù)后，hepcidin陽性表達(dá)水平較APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬CA3區(qū)明顯升高(P<0.05)。復(fù)方組和DFX組相比，hepcidin陽性表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 1 Effects of active components of Epimedium, Astragalus and Radix Puerariae on expression of hepcidin in hippocampus CA3 in APPswe/PS1dE9 double transgenic Alzheimer’s disease

Control: C57BL/6J; Model: APPswe/PS1dE9 double transgenic AD model mice; Tg effective fraction: After Tg effective fraction treatment; DFX: After deferox treatment.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.2 Real-time PCR和Western blot結(jié)果Real-time PCR(Fig 2)及Western blot(Fig 3)結(jié)果顯示，APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬CA3區(qū)hepcidin在mRNA水平和蛋白水平均較正常對照組明顯降低(P<0.05)，給予淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方和DFX灌胃處理后，hepcidin表達(dá)水平較APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬CA3區(qū)明顯升高(P<0.05)。復(fù)方組和DFX組相比，hepcidin在mRNA水平和蛋白水平差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 2 Effects of active components of Epimedium, Astragalus and Radix Puerariae on expression of hepcidin mRNA in hippocampus CA3 in APPswe/PS1dE9 double transgenic Alzheimer’s disease model n=10)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

Fig 3 Effects of active components of Epimedium, Astragalus and Radix Puerariae on expression of hepcidin protein in hippocampus CA3 in APPswe/PS1dE9 double transgenic Alzheimer’s disease model n=10)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

3 討論

AD已成為威脅老年人生活質(zhì)量并導(dǎo)致死亡的最嚴(yán)重疾病之一[6]，AD的患病率隨著年齡的增長呈逐步上升趨勢，在65歲以上人群中發(fā)病率為5%，而在85歲以上人群中發(fā)病率已高達(dá)20%。AD是一種多病因介導(dǎo)的疾病，其發(fā)病機(jī)制學(xué)說有很多，其中包括以Aβ毒性學(xué)說為核心的Tau蛋白異常學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、基因突變學(xué)說、金屬離子代謝紊亂學(xué)說等，其中金屬離子代謝紊亂學(xué)說是目前研究的一個重點(diǎn)。鐵是人體內(nèi)必不可少的微量元素，對腦的正常發(fā)育和生理功能的維持是十分重要的。當(dāng)腦內(nèi)缺乏鐵時會導(dǎo)致中樞神經(jīng)遞質(zhì)合成障礙和語言、運(yùn)動平衡等行為學(xué)功能延遲發(fā)育[7]。當(dāng)腦內(nèi)鐵超載時，異常增高的腦鐵會通過以下幾個方面促進(jìn)AD的發(fā)生：①促進(jìn)Aβ分泌；②和Aβ結(jié)合，促進(jìn)Aβ的聚集及纖維化；③和過磷酸化的Tau蛋白結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)形成；④通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生自由基，加劇神經(jīng)元損傷。大量的臨床和基礎(chǔ)研究均顯示，在AD時腦組織鐵含量增高，且腦鐵升高的部位與病變累及部位一致，如海馬、皮層等鐵水平出現(xiàn)異常的升高[8]。同時已有研究表明腦組織內(nèi)鐵含量升高程度與癡呆程度呈明顯相關(guān)性[9]。以上研究證據(jù)表明，異常增高的腦鐵參與了AD的病理過程，可能在AD發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。因此，近些年鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白與AD的關(guān)系是AD研究的熱點(diǎn)問題，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白包括二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白、腸細(xì)胞色素b、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2、銅藍(lán)蛋白、血幼素、hepcidin等，其中hepcidin是近年來發(fā)現(xiàn)的重要鐵調(diào)節(jié)激素，是維持細(xì)胞內(nèi)正常鐵代謝的重要金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它精確調(diào)控鐵吸收、鐵儲存和鐵釋放過程[10]。hepcidin是由25個氨基酸組成的多肽，主要在肝臟合成并成熟，隨后分泌到血液中，轉(zhuǎn)運(yùn)到其主要靶器官，包括小腸、肝臟、骨髓細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，控制這些器官的鐵代謝活動[11-12]。血液中hepcidin濃度增加，將抑制小腸上皮細(xì)胞鐵吸收蛋白的表達(dá)、進(jìn)而抑制小腸鐵吸收；同時增加肝臟細(xì)胞，骨髓細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對鐵的攝取，進(jìn)而增加鐵儲存和鐵利用。通過這一hepcidin介導(dǎo)的途徑，可有效緩解鐵超載[13]。反之，hepcidin敲除或者濃度降低，鐵的吸收會增加，而鐵的儲存和利用減少，造成鐵超載[14]。因此，hepcidin是維持細(xì)胞內(nèi)正常鐵代謝的重要金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著中心作用。

AD患者腦鐵的異常積聚作為“內(nèi)毒”的一種，在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但目前AD患者腦鐵升高的原因還不是十分清楚[15]。中醫(yī)認(rèn)為腦鐵的異常積聚是由于腎虛精虧，導(dǎo)致元神受抑，不能驅(qū)毒外出，兼心肝脾衰弱，致使氣血運(yùn)行失常，不能使鐵毒及時、有效地清除并停留于腦內(nèi)，蘊(yùn)積過多而致神機(jī)受損。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)的AD患者腦內(nèi)某些鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)失控是相一致的。再者，AD患者腎功能衰退，促紅細(xì)胞生成素(EPO)分泌不足，紅細(xì)胞生成減少，以至于鐵利用降低，造成機(jī)體儲鐵增加也是導(dǎo)致外周鐵代謝失衡的關(guān)鍵。因此，淫羊藿、黃芪、葛根三藥組方，具補(bǔ)腎健脾、生精養(yǎng)髓、益氣養(yǎng)血、滌痰化瘀、調(diào)暢氣機(jī)之功效，可扶正祛邪，使鐵毒得以清除。

因此，淫羊藿、黃芪、葛粉有效組分復(fù)方可以有效上調(diào)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬CA3區(qū)hepcidin的表達(dá)，從而減少APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦鐵超載，該結(jié)果提示，淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可以減少鐵超載而對神經(jīng)元起保護(hù)作用。