宋 峰，王 瑾，王 麗，焦向英

(山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院1. 生理學系、2. 病理學教研室，山西 太原 030001)

“炎癥學說”作為糖尿病發(fā)病的重要學說之一近年來已得到國內外專家的普遍認可。研究表明，糖尿病患者血清中含有多種炎癥因子，已知這些炎性因子可通過多種方式導致胰島β細胞出現(xiàn)結構損傷、功能障礙，隨之引起胰島素分泌不足，難以支撐正常的生物學功能，其中包含白介素-1β(interleukin，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor -ɑ，TNF-ɑ)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等[1, 2]。IL-1β是一種以單核-巨噬細胞為主的一系列細胞分泌并合成的強力炎性細胞因子[3, 4]。正常情況下，IL-1β不表達，但病理條件下，如動脈粥樣硬化、類風濕關節(jié)炎和糖尿病時其表達升高。已有研究證實，IL-1β可促進胰島β細胞的凋亡，進而促進糖尿病發(fā)生發(fā)展[5]，但是炎性因子IL-1β誘導胰島β細胞凋亡的確切機制目前仍不明確。

細胞自噬是指細胞利用溶酶體將細胞內錯誤折疊的蛋白質和受損細胞器進行降解并回收利用，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，使細胞在不利環(huán)境下得以生存并保持健康狀態(tài)[6]。自噬在真核細胞中是一種非常普遍的現(xiàn)象。適度自噬能使靶細胞對外界損傷做出反應，使其存活；同時也能將受損的細胞器清除，利于細胞穩(wěn)態(tài)的維持[6]；然而，有研究表明，過度激活的自噬可以促進細胞發(fā)生凋亡，造成細胞損傷[7]。大量研究表明，糖尿病發(fā)生時胰島組織自噬相關蛋白表達升高，那么IL-1β作為糖尿病及其并發(fā)癥時存在的一種重要炎性細胞因子，是否可以通過誘導自噬發(fā)生，進而導致胰島β細胞凋亡呢？本研究擬探討IL-1β誘導凋亡產(chǎn)生過程中自噬是否發(fā)揮重要作用，從而為糖尿病的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料INS-1細胞(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所-協(xié)和細胞庫)；IL-1β(Peprotech公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(北京賽澳美細胞有限公司)；抗LC3抗體(Sigma)；抗Beclin 1抗體(Abcam)；CCK-8試劑盒(武漢索萊寶)；抗cleaved-caspase-3抗體和caspase-3抗體(美國CST公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(美國Bio-Rad公司)；3-甲基腺嘌呤(3-MA)(Sigma)；雷帕霉素(rapamycin，RAPA) (美國MedChem Express)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 將INS-1細胞分為對照組(IL-1β 0 mol·L-1)和IL-1β處理組(IL-1β 10-9、10-8、10-7mol·L-1)共4組。

1.2.2細胞存活率檢測 收集處于對數(shù)期長勢良好的INS-1細胞，調整加入培養(yǎng)基的量使得加入96孔板里的細胞密度維持在約5 000/孔，每孔加入100 μL細胞懸液，待貼壁后加入不同濃度的IL-1β(10-9、10-8、10-7mol·L-1)，同時設置對照組，觀察不同濃度的IL-1β 處理對INS-1胰島β細胞的影響。5% CO2，37 ℃培養(yǎng)細胞24 h，隨后每孔加入10 μL CCK-8檢測用液，在細胞培孵育箱內再培養(yǎng)1 h，酶標儀(美國Molecular Devices公司)檢測其450 nm波長時的吸光度。分別處理不同時間(0、6、12、24、48 h)，然后與上述同樣步驟在450 nm處測定其吸光度。細胞存活率/%=[(實驗組-空白組)/(對照孔-空白孔)]×100%

1.2.3Western blot檢測凋亡、自噬 細胞分2部分進行處理：一部分在INS-1細胞中分別加入0、10-9、10-8、10-7mol·L-1的IL-1β培養(yǎng)24 h，收集細胞；另一部分先用RAPA(5×10-6mol·L-1)或者3-MA(10-5mol·L-1)預處理細胞1 h，隨后加入10-8mol·L-1的IL-1β在37 ℃培養(yǎng)24 h后收集細胞。測定凋亡相關蛋白cleaved caspase-3、caspase-3，以及自噬相關蛋白LC3、Beclin 1、P62的表達。收集細胞于EP管中，加入101 μL 混合液(100 μL RIPA裂解液和1 μL的苯甲基磺酰氟PMSF)吹散細胞，超聲波碎裂細胞，4 ℃放置2～3 h，12 000 rpm離心15min，取上清。BCA法測蛋白濃度，選擇40 μg蛋白上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉膜，封閉用5% BSA、2 h，TBST洗膜3次之后一抗4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，洗滌后二抗孵育2 h，用ECL超靈敏發(fā)光液進行曝光。所得條帶用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 將待測細胞用胰酶消化下來，10 mL管收集細胞，PBS洗滌細胞3次，放入玻璃管中離心1 000 rpm，5 min。再加入1 mL PBS，混合為細胞懸液，用濾過膜過濾，收集于流式玻璃管中，沖洗2次， 800 rpm離心5min。加入200 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)混勻。室溫下避光靜置15 min，流式細胞儀(美國BD公司)檢測細胞凋亡。細胞凋亡率/%=細胞凋亡數(shù)/細胞總量×100%。

2 結果

2.1 IL-1β導致大鼠INS-1胰島β細胞的存活率下降，且呈濃度及時間依賴性與對照組(0 mol·L-1)相比，隨著IL-1β濃度的升高，INS-1細胞存活率逐漸下降，在10-8mol·L-1時下降顯著[(78.25±1.97)%,P<0.01](Fig 1A)；使用10-8mol·L-1IL-1β分別以6、12、24、48 h不同時長培養(yǎng)INS-1細胞，與0 h相比，IL-1β作用24 h時細胞活力顯著下降[(77.98±0.97)%,P<0.01](Fig 1B)。以上結果提示，采用IL-1β處理胰島β細胞可以引起細胞存活率呈濃度和時間依賴性下降(Fig 1)。

2.2 IL-1β可以濃度及時間依賴性促進INS-1細胞凋亡Western blot結果顯示，隨著IL-1β濃度的增加，cleaved caspase-3/caspase-3比值不斷增加 (Fig 2A)。進一步采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術觀察IL-1β干預不同時長對INS-1胰島β細胞凋亡的影響。結果顯示:與對照組(3.01±0.89)%相比，12 h細胞凋亡比率(12.12±1.18)%明顯升高(P<0.01)，36 h細胞凋亡率達到(22.32±1.30)%，明顯高于對照組(P<0.01)(Fig 2B)。提示，IL-1β可以誘導胰島β細胞凋亡增加。

Fig 1 Viability of INS-1 cells decreased by IL-1β in a concentration-and time-dependent

A:INS-1 cells were pretreated with IL-1β at different concentrations, and survival rates were measured by CCK-8 assay. B:INS-1 cells were treated with IL-1β (10-8mol·L-1),and the survival rate were measured at different time points.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.3 IL-1β可濃度依賴性的上調INS-1細胞自噬水平使用不同濃度(0、10-9、10-8、10-7mol·L-1)的IL-1β處理INS-1細胞24 h，用Western blot檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin1、P62的表達水平。結果顯示，隨著IL-1β處理濃度的不斷增大，LC3和Beclin1蛋白水平不斷增加(P<0.05，P<0.01)，而P62蛋白表達則逐漸下降(P<0.01)(Fig 3)。提示，IL-1β可以誘導胰島β細胞自噬增加。

2.4 雷帕霉素上調自噬可增加IL-1β誘導的INS-1細胞凋亡蛋白表達增加使用自噬激動劑雷帕霉素(RAPA)預處理細胞1 h后，再給予10-8mol·L-1的IL-1β培養(yǎng)24 h，用Western blot檢測細胞凋亡水平。結果顯示，RAPA預處理組細胞自噬相關蛋白LC3和 Beclin 1的水平明顯高于IL-1β組(P<0.01)，P62水平明顯低于IL-1β組(P<0.01)，證明RAPA可以上調INS-1細胞自噬。檢測凋亡水平發(fā)現(xiàn)，與IL-1β組相比，用RAPA預處理細胞后，cleaved caspase-3/caspase-3比值明顯增加(P<0.05)，提示RAPA可以通過上調自噬進一步增加IL-1β誘導的INS-1細胞凋亡(Fig 4)。

Fig 2 Apoptosis of INS-1 cells promoted by

A:Detection of apoptosis in INS-1 cells incubated with different concentrations of IL-1β by Western blot.**P<0.01vscontrol group. B:Detection of apoptotic ratio in INS-1 cells incubated with IL-1β at different time by flow cytometry.**P<0.01vscontrol group.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.5 3-MA下調自噬可逆轉IL-1β誘導的INS-1細胞凋亡水平增加3-Methyladenine(3-MA)是常用自噬抑制劑。采用3-MA預處理細胞1 h后，再給予IL-1β(10-8mol·L-1)培養(yǎng)24 h，Western blot檢測細胞自噬和凋亡水平。Western blot 結果顯示，3-MA預處理組細胞自噬相關蛋白LC3和Beclin 1的水平明顯低于IL-1β組(P<0.01)，P62水平明顯高于IL-1β組(P<0.01)，證明3-MA可以下調自噬。接著檢測凋亡水平發(fā)現(xiàn)，與IL-1β組相比，用3-MA預處理細胞后，cleaved caspase-3/caspase-3比值下降(P<0.05)，提示3-MA抑制自噬可減少IL-1β誘導的INS-1細胞凋亡(Fig 5)。

3 討論

流行病學調查表明，2型糖尿病的發(fā)病率已達到223～345/萬人[8]，但糖尿病的發(fā)病機制仍未完全闡明。近年來眾多研究者對糖尿病的“炎癥學說”[1]頗為認可。在2型糖尿病的發(fā)病過程中，當胰島β細胞功能衰竭時，可以誘導TNF-ɑ、IL-1β等炎癥因子的富集，進而造成胰島β細胞的損傷。生理情況下細胞內的IL-1β是無活性的，當受到刺激引發(fā)炎癥時，IL-1β剪切為有活性的IL-1β分泌到細胞外發(fā)揮作用[2]。在炎癥發(fā)生過程中，IL-1β可誘導細胞凋亡，破壞胰島β細胞膜的完整，進而減少胰島素分泌，降低胰島素受體的敏感性[9-10]，但IL-1β對于胰島細胞損傷的作用及可能原因尚不清楚。本研究首先證明IL-1β可以降低INS-1細胞的存活率，同時采用流式細胞術和Western blot方法檢測了IL-1β對INS-1細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)IL-1β可以濃度和時間依賴性的促進INS-1細胞凋亡，從而明確了IL-1β具有誘導胰島β細胞凋亡和細胞損傷的作用。但IL-1β誘導胰島β細胞凋亡的機制尚不明確。

Fig 4 Apoptosis of INS-1 cells induced by IL-1β was increased by up-regulation of

A:RAPA induced the expression of autophagy-associated proteins. B:Apoptosis was promoted by RAPA.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIL-1β group.

Fig 5 Apoptosis of INS-1 cells induced by IL-1β was reduced by down-regulation of

A:3-MA inhibited the expression of autophagy-associated proteins. B:Apoptosis was inhibited by 3-MA.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIL-1β group.

自噬是細胞將自身受損的細胞器或錯誤折疊的蛋白質經(jīng)過包被形成囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，通過降解其所包裹的內容物來發(fā)揮作用。自噬的作用尚存爭議。有研究表明，自噬可以調控胰島素信號途徑，產(chǎn)生胰島素抵抗的主要原因是自噬水平的降低，通過對自噬進行調控來預防胰島β細胞結構及功能的損傷對于治療糖尿病有重要的意義[12]。但是，亦有研究發(fā)現(xiàn)過度的自噬又可能對細胞造成損傷[13]。然而，自噬是否直接參與2型糖尿病的產(chǎn)生和后續(xù)發(fā)展及其具體的機制尚不清楚。LC3、Beclin 1和p62是細胞自噬的標志性蛋白。自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會轉變?yōu)槟ば?即LC3-Ⅱ)，自噬的程度可用LC3-II/LC3-I比值評價；Beclin 1是哺乳類動物參與自噬的特異性基因；P62是自噬選擇性底物，P62消耗越多即水平越低提示自噬水平越高[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)，IL-1β可以濃度依賴性的增加LC3、Beclin 1的表達，降低P62的表達，提示IL-1β可以促進胰島β細胞自噬的發(fā)生。為進一步研究自噬在IL-1β誘導的胰島β細胞凋亡發(fā)揮的作用情況，我們分別采用自噬激動劑RAPA和自噬抑制劑3-MA預處理INS-1細胞上調或抑制自噬，結果發(fā)現(xiàn)，上調自噬IL-1β誘導的細胞凋亡蛋白的表達進一步增加，抑制自噬IL-1β誘導的細胞凋亡蛋白表達的增加被逆轉。由此說明自噬的增加可以促進IL-1β誘導的胰島β細胞的凋亡水平，下調自噬可以減輕IL-1β引起的INS-1胰島β細胞的凋亡。

綜上所述，本研究結果表明，炎癥因子IL-1β可以促進INS-1胰島β細胞的凋亡，這一作用可能是由IL-1β增加細胞自噬引起的。但是，IL-1β增加自噬水平的可能機制尚不明確，有待進一步的研究。

(致謝：本實驗在山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學系、細胞生理學教育部重點實驗室完成，在此感謝在實驗中給予指導和幫助的各位老師和同學。)