王可欣，陳彩玲，鄭曉艷，劉翠娟，崔 燎,2，許碧蓮,2，吳 鐵,2,3

(1.廣東醫(yī)科大學藥理教研室；2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023；3.廣東醫(yī)科大學·廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心，廣東 東莞 523808)

隨著社會人口老齡化的到來，與增齡相關的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病日益受到關注。骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是指骨質減少和骨組織微結構惡化導致骨脆性增加和易感性骨折的疾病[1]。而肌少癥(sarcopenia，SP)則被認為能影響機體平衡增加跌倒風險，從而使老年人功能受限[2]。兩種疾病相互影響，緊密關聯(lián)，如何解決老年性肌少癥伴隨而來的骨質疏松骨折風險，是一個不容忽視的問題。輔酶Q10是生物體內廣泛存在的一類脂溶性醌類物質，具有較強抗氧化和清除氧自由基的的能力，還能改善線粒體的功能障礙[3]。隨著年齡增長，輔酶Q10合成能力下降，老年人體內輔酶Q10含量降低，因此通過外源性補充十分必要[4]。一方面[5]，輔酶Q10能促進成骨細胞的分化，并抑制破骨細胞的分化，從而使骨量增加。另一方面[6]，輔酶Q10對缺血/再灌注造成的骨骼肌損傷具有保護作用，該損傷是由于氧自由基的產生和促炎細胞因子的合成與釋放造成。因此，本研究建立D-半乳糖小鼠的亞急性衰老模型，觀察輔酶Q10是否能夠同時作用于肌肉骨骼系統(tǒng)，為臨床上治療“骨質疏松癥-肌少癥”的難題提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SPF級8周齡雄性KM小鼠，體質量(30±5) g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，合格證號：SYXK(粵)2013-0002。

1.2 藥物與試劑骨化三醇，購于Hoffmann-La Roche AG，批號：B4208。D-半乳糖，購于索萊寶，批號：129G051。生理鹽水，購于石家莊四藥有限公司，批號1703032103。

1.3 儀器PTY-224-423電子天平(福州華志科學儀器有限公司)；數控超聲波清洗器KQ5200DB(昆山超聲儀器有限公司)；858 Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)(美國MST公司)；Viva Micro CT 40(SCANCO Medical AG)；ZTS-20N拉力檢測儀(日本IMADA)；JEM 1400(日本JEOL)

1.4 實驗動物分組與給藥根據體質量按隨機區(qū)組法，將小鼠平均分配到4組，每組10只，具體分組及給藥為：(1)正常對照組(Control)：皮下注射及灌胃給予生理鹽水；(2)D-半乳糖模型組(Model)：皮下注射500 mg·kg-1·d-1D-半乳糖(生理鹽水溶解D-半乳糖，濃度為0.28 mol·L-1)，并灌胃給予生理鹽水；(3)骨化三醇組(Calcitriol)：造模方法同模型組，然后按0.076 μg·kg-1·d-1灌胃骨化三醇混懸液(取一粒含0.25 μg骨化三醇的膠囊，加入33.3 mL生理鹽水，室溫超聲60 min，超聲功率為70%)。(4)輔酶Q10組(CoQ10)：造模方法同模型組，然后按250 mg·kg-1·d-1灌胃輔酶Q10紫蘇籽油溶液(將1 250 mg輔酶Q10加入到50 ml紫蘇籽油中，攪拌溶解即得)。所有小鼠連續(xù)給藥12周。每周稱體質量1次，從第8周開始，每7 d測一次雙前肢肌力。實驗結束時，取左側股骨進行micro-CT及骨生物力學檢測，取腓腸肌做超微透射電子顯微鏡檢查。

1.5 觀察指標及測定方法

1.5.1體質量的檢測 每周稱體質量1次，實驗結束取材前稱體質量，作為實驗結束時的體質量。實驗開始前和實驗結束時的體質量的差值，即為體質量凈增長值(△W)。

1.5.2股骨質量和質量指數的檢測 取股骨，除凈表面附著組織，用濾紙吸干表面體液，電子天平稱重，即得股骨質量。股骨質量/實驗結束時體質量，即為股骨質量指數。

1.5.3雙前肢肌力的檢測 將小鼠雙前肢放在拉力計的感應網處，待小鼠適應1 min后輕輕提起尾部使之與身體平行， 向小鼠前傾的相反方向緩慢用力拖拽，0.5～1 min讀數，每只小鼠測定3次，取拉力讀數最大的數值。

1.5.4骨生物力學的檢測 用858 Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)進行三點彎曲實驗，分析股骨生物力學性能。把股骨放在MTS實驗機上，加載速度為0.155 mm·s-1，跨距5 mm。繪制載荷-形變曲線，從曲線上讀取數據，根據相應的公式計算參數指標：最大載荷(maximum load)、 斷裂載荷(break load)、彈性載荷(elastic load)、剛性系數(stiffness) 。

1.5.5micro-CT的檢測 將股骨沿著長軸放在固定器內，用viva CT40對股骨干骺端進行掃描。viva CT40選擇掃描參數：能量/強度為70 kVP，114 μA，8 W，掃描時間為29.7 min，片數Slice為505。掃描完成后，選取距生長板遠端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質骨感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)行三維重建，以最低閾值為148提取圖像信息。使用其軟件(SCANCO Medical AG)進行重建定量分析。參數如下：連接密度(connectivity density，Conn.D.)、結構模型指數(structure model index，SMI)、骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.5.6腓腸肌透射電子顯微鏡的檢測 將新鮮組織沿縱軸用鋒利手術刀片切成寬為1 mm，長為2～3 mm的組織塊，投入質量濃度為30 g·L-1的戊二醛溶液中，4 ℃固定24 h。依次經磷酸緩沖溶液漂洗、質量濃度為10 g·L-1的鋨酸溶液固定、逐級乙醇和丙酮脫水、包埋劑浸透與聚合，1～2 μm半薄切片定位后，切60 nm超薄切片，染色后干燥并在透射電子顯微鏡下觀察。

使用Gantan832軟件，隨機視野拍10張，放大倍數分別為15 000倍和40 000倍。畫出并統(tǒng)計肌原纖維中的肌小節(jié)(sarcomere，S)、明帶(I-band, I)、暗帶(A-band，A)、H帶(H-zone, H)、M線(M-line, M)、Z線(Z-line, Z)和重疊肌動蛋白和肌球蛋白肌絲(overlapped actin and myosin myofilaments，O)長度。

Tab 1 Body weight changes of mice n=10)

2 結果

2.1 各組小鼠體質量變化和體質量凈增長比較由Tab 1可見，各組間小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由Tab 2可見，與正常對照組相比，模型組體質量凈增長明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，骨化三醇組和輔酶Q10組體質量增長均明顯增加(P<0.05)。

Tab 2 Changes of net weight gain n=10)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.2 各組小鼠股骨質量及質量指數變化由Tab 3可見，與正常對照組相比，模型組股骨質量明顯減少(P<0.05)，股骨質量指數有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。與模型組相比，骨化三醇組和輔酶Q10組股骨質量及質量指數均明顯增加(P<0.05)。

2.3 各組小鼠前肢肌力的變化由Tab 4可見，第8周開始，與正常對照組相比，模型組雙前肢肌力有下降趨勢。與模型組相比，用藥組雙前肢肌力無明顯改變。

Tab 3 Changes of femur mass and femur mass index n=10)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.4 各組小鼠股骨生物力學參數的變化由Tab 5可見，與正常對照組相比，模型組股骨最大載荷、剛性系數分別下降19.8%、23.7%(P<0.01)。與模型組相比，骨化三醇組最大載荷、剛性系數分別增加26.9%(P<0.05)、13.2%(P<0.01)；輔酶Q10組最大載荷增加26.5%(P<0.01)。

2.5 各組小鼠股骨遠端松質骨micro-CT定量參數的變化由Tab 6可見，與正常對照組相比，模型組micro-CT參數Conn.D、BMD降低(P<0.05)，而Tb.Sp增加(P<0.05)。與模型組相比，骨化三醇組BMD、Tb.Th增加(P<0.05)，而Tb.Sp降低(P<0.05)；輔酶Q10組Conn.D.、BMD、Tb.Th均增加(P<0.05)，而SMI、Tb.Sp明顯下降(P<0.01)。

2.6 各組小鼠股骨遠端松質骨micro-CT二維圖和三維圖的變化由Fig 1 可見，正常對照組股骨骨小梁數量豐富而致密。與正常對照組相比，模型組骨小梁數量較少，排列稀疏。與模型組相比，骨化三醇組和輔酶Q10組骨小梁數量豐富而密集，連續(xù)性好。

Fig 1 2D reconstruction of micro-CT of mouse femur from control mice(A), model mice(B), calcitriol mice(C) and CoQ10mice(D)

由Fig 2 可見，正常對照組股骨骨小梁較粗，空隙較小，網狀結構明顯。與正常對照組相比，模型組骨小梁缺失明顯，網狀結構退化。與模型組相比，骨化三醇組和輔酶Q10組骨小梁較粗，網狀結構明顯。

Tab 4 Changes of grip strength of forelimb n=10)

Fig 2 ROI region 3D reconstruction of micro-CT of mouse femur from control group(A), model group(B), calcitriol group(C) and CoQ10 group(D)

Tab 5 Changes of biomechanical properties in femur

*P<0.05 ,**P<0.05vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 6 Changes of micro-CT scanning

*P<0.05vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.7 各組小鼠腓腸肌透射電子顯微鏡的變化由Fig 3A和Fig 4A可見，正常組腓腸肌肌纖維排列有序，肌絲排列整齊，肌纖維間可見卵圓形線粒體，線粒體嵴較為清晰。由Fig 3B和Fig 4B可見，模型組腓腸肌肌纖維和肌絲排列不夠緊密，肌絲或肌原纖維間存在縫隙和空洞，A帶出現(xiàn)斷裂，肌原纖維間出現(xiàn)數量豐富且異常增大的線粒體，其形狀不規(guī)則，有的長度可超過一個肌小節(jié)。Fig 3C和Fig 4C可見，骨化三醇組的肌絲排列整齊，可見豐富的肌質網和橫管系統(tǒng)，肌原纖維間存在少量卵圓形線粒體。Fig 3D和Fig 4D可見，輔酶Q10組的肌原纖維束排列有序而緊湊，可見卵圓形線粒體，線粒體嵴較為清晰。

2.8 各組小鼠腓腸肌肌原纖維各功能結構的長度測量由Tab 7可見，與正常對照組相比，模型組腓腸肌纖維的肌小節(jié)、I帶、H帶、M線和Z線長度明顯增加(P<0.01)，重疊肌動蛋白和肌球蛋白肌絲長度明顯縮短(P<0.01)。與模型組相比，骨化三醇組和輔酶Q10組腓腸肌肌纖維的I帶、H帶、M線和Z線均明顯縮短(P<0.01)，而重疊肌動蛋白和肌球蛋白肌絲長明顯增長(P<0.01)。

Tab 7 Changes of structural parameters of myofibril in gastrocnemius n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

Fig 3 Electron micrographs of longitudinal sections of gastrocnemius myofibers from control group(A), model group(B), calcitriol group(C) and CoQ10 group(D)(15 000×)

S, sarcomeres; A, A-band; I, I-band; white arrowheads, intermyofibrillar mitochondria

Fig 4 Electron micrographs of longitudinal sections of gastrocnemius myofibers from control group(A), model group(B),calcitriol group(C) and CoQ10 group(D)(40 000×)

H, H-zone; M, M-line; white arrowheads, intermyofibrillar mitochondria; black arrowheads, cavity

3 討論

與正常對照組相比，D-半乳糖模型組小鼠體質量凈增長值明顯下降，說明D-半乳糖能導致小鼠體質量減輕。micro-CT定量參數的結果顯示，與正常對照組相比，D-半乳糖組的Conn.D.和BMD降低，而Tb.Sp增加。micro-CT的三維重建圖中可見，模型組骨小梁排列稀疏，存在較大空洞，網狀結構明顯退化。結果表明，連續(xù)12周皮下注射500 mg·kg-1·d-1D-半乳糖，能致雄性小鼠骨量減少及骨微結構損傷。本次研究結果與課題組前期研究[7]相一致。D-半乳糖代謝過程中產生的自由基能破壞膠原蛋白，引起骨礦物質流失，加速雄鼠衰老，導致骨量丟失[8]，同時D-半乳糖轉化為晚期糖基化終產物(AGEs)在組織中累積，增加成骨細胞中蛋白水解酶的活性，從而誘導成骨細胞凋亡。

通過超微透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組肌小節(jié)、I帶、H帶、M線和Z線長度顯著性增長，重疊肌動蛋白和肌球蛋白的肌絲長度明顯減少，且肌原纖維間存在大量形狀不一的龐大線粒體。該發(fā)現(xiàn)與Sayed等[9]報道類似，老年鼠的肌原纖維中肌小節(jié)，I帶和H帶長度隨著年齡增長而增加，而A帶沒有變化，并且肌原纖維間線粒體數量和橫截面積明顯增加。

肌原纖維是骨骼肌細胞的收縮單位，肌原纖維的成分直接影響著肌肉的生物學性能。當肌纖維被拉伸時，肌纖維伴隨著I帶延長而變長，而當肌纖維收到刺激而收縮并重疊時，肌纖維和I帶會變短。通過拉伸和收縮，A帶保持恒定長度，根據延長或縮短肌小節(jié)和I帶，H帶長度也發(fā)生改變[10]。本研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖誘導的衰老小鼠腓腸肌收縮性能下降，與老年小鼠的骨骼肌老化相似。這是由于D-半乳糖可以誘導線粒體DNA的缺失增加，導致三磷酸腺苷(ATP)水平下降，電子傳遞鏈復合物水平下降，最終誘導線粒體功能障礙[11]。模型組出現(xiàn)的大量龐大的線粒體，可能由于線粒體損傷，骨骼肌需要更多的能量，從而引發(fā)線粒體代償性增加，以此供應氧化磷酸化障礙所致的能量缺乏[12]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，輔酶Q10組小鼠體質量凈增長值明顯增加，說明外源性補充輔酶Q10能保護D-半乳糖導致的小鼠體質量減輕。與模型組相比，輔酶Q10組小鼠股骨質量和股骨質量分數明顯增加。此外，與模型組相比，輔酶Q10能明顯增加股骨最大載荷、BMD和Tb.Th，并降低Tb.Sp。股骨micro-CT三維重建圖可見，輔酶Q10組骨小梁較粗而厚且數量豐富。結果提示，輔酶Q10能增加股骨質量，改善D-半乳糖所致的骨微結構損傷，從而使骨骼的質量和功能上得到保護。

超微透射電子顯微鏡檢查的結果顯示，與模型組相比，輔酶Q10組的腓腸肌肌原纖維排列更為整齊，肌絲排列緊湊，線粒體形狀規(guī)則且清晰。輔酶Q10組I帶、H帶、M線和Z線長度明顯縮短，而重疊肌動蛋白和肌球蛋白肌絲長度明顯增加，同時，輔酶Q10組并無觀察到龐大線粒體。研究結果提示，輔酶Q10能夠改善D-半乳糖造成的小鼠肌纖維收縮性能下降，維持肌原纖維結構的完整。進一步說明輔酶Q10對肌肉有保護作用。

輔酶Q10是人體重要的抗氧化劑和非特異性免疫增強劑，其生理功能廣泛，除具有較強清除自由基和抗氧化功能、增強心臟動力和調節(jié)血脂等功能[3]，還在抗骨質疏松作用方面有良好效果。研究表明[13]，輔酶Q10既是成骨細胞生成核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)誘導的破骨細胞分化的抑制劑，也是成骨細胞分化的促進劑，其能明顯抑制破骨細胞NFATc 1、TRAP和破骨細胞相關免疫球蛋白樣受體的基因表達，并通過轉錄因子活性促進骨分化過程中的再生。

輔酶Q10能改善D-半乳糖致雄性小鼠腓腸肌肌原纖維超微結構，主要原因可能是一方面外源性補充輔酶Q10能加速清除D-半乳糖代謝產生的自由基堆積，降低氧化應激的水平，抑制線粒體的過氧化保護生物膜結構的完整性[14]，使線粒體中氧化磷酸化活動得以維持，因而機體的能量負荷減輕。另一方面，輔酶Q10彌補了D-半乳糖致衰老小鼠體內輔酶Q10的缺失，輔助線粒體中ATP的磷酸還原作用，讓細胞能量供應系統(tǒng)快速活化，從而增強老年機體的體能和精力[4]。此外，輔酶Q10還能通過復雜的分子機制作用于骨骼肌細胞。Boroujeni等[6]發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10能通過抑制核因子κB(NF-κB)的活化作用，減少骨骼肌缺血再灌注模型大鼠腓腸肌中腫瘤壞死因子(TNF-α)和 NF-κB的表達，從而減輕肌纖維變性和肥大細胞浸潤。

本研究中還同時觀察了骨化三醇對D-半乳糖致雄性小鼠骨骼和肌肉的影響，發(fā)現(xiàn)骨化三醇對改善骨微結構破壞和肌肉肌原纖維的損壞也有益處。已有證據表明[15]，維生素D能增加肌肉內蛋白質合成及肌質網內鈣的吸收，并且可以調節(jié)骨鈣蛋白和相關炎癥因子從而影響肌肉系統(tǒng)的生長發(fā)育過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)12周皮下注射500 mg·kg-1·d-1D-半乳糖可致小鼠發(fā)生骨微結構破壞，并引起肌原纖維結構損傷。本研究創(chuàng)新之處在于首次觀察輔酶Q10對這種D-半乳糖致亞急性衰老小鼠骨骼和肌原纖維損傷有明顯的保護作用，提示了輔酶Q10能夠同時作用于肌肉系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)，為臨床上預防和治療男性骨質疏松合并肌肉減少的患者提供了實驗研究數據，為臨床解決“骨質疏松癥-肌少癥”的治療難題提供參考依據。但輔酶Q10究竟如何作用于D-半乳糖誘導的亞急性衰老小鼠的骨骼肌細胞仍需進一步地探討。

(致謝：本實驗在廣東醫(yī)科大學藥理學實驗室完成，感謝各位老師和同學的幫助)