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        Nrf2在膿毒癥合并急性腎損傷大鼠腎組織中的表達(dá)及姜黃素對其的干預(yù)作用*

        2019-11-06 06:23:02楊挺俞慧黃偉
        關(guān)鍵詞:勻漿姜黃造模

        楊挺, 俞慧, 黃偉

        (江南大學(xué)附屬醫(yī)院 & 無錫市第三人民醫(yī)院 急診科, 江蘇 無錫 214000)

        膿毒癥是機(jī)體對細(xì)菌感染作出過度反應(yīng)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),如不及時(shí)處理則進(jìn)展為嚴(yán)重膿毒癥,出現(xiàn)膿毒癥休克、多器官功能衰竭,若合并急性腎損傷(AKI)時(shí),死亡率可達(dá)70%[1]。膿毒癥AKI的發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明,對AKI的研究早期主要集中于血流動力學(xué)或(和)炎癥因子方面,近幾年的研究證實(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)在膿毒癥過程中起著重要的作用。核因子相關(guān)因子(Nrf2)是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一,Nrf2/ARE通路是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[2-3]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制備大鼠膿毒癥AKI模型,并應(yīng)用姜黃素進(jìn)行干預(yù)治療,于造模后6、12、24及48 h時(shí),檢測大鼠腎組織中Nrf2蛋白及血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平,探討姜黃素在膿毒癥AKI中的作用及機(jī)制,為膿毒癥AKI的臨床治療提供思路。

        1 材料與方法

        1.1動物及試劑 清潔級雄性SD大鼠96只,體質(zhì)量(260±20)g,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;AU400全自動生化分析儀購自日本olympus公司,尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

        1.2方法

        1.2.1動物模型制備 96只大鼠隨機(jī)均分為對照組、模型組、治療組。模型組和治療組大鼠參考文獻(xiàn)[4-5]采用CLP法制備膿毒癥AKI大鼠模型,造模前大鼠禁食12 h、禁水6 h,以3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉,固定大鼠于操作臺,剪去腹部體毛、消毒后沿腹正中線皮膚開約2 cm切口,暴露腹腔臟器;找到盲腸游離盲端,取出盲腸,在距盲端1 cm處結(jié)扎,用18號針頭在近端及末端貫通穿刺2次,施壓于盲腸擠出少量腸內(nèi)分泌物于腹腔內(nèi),放置1根直徑約0.5 cm的硬質(zhì)導(dǎo)管并固定,回納盲腸,逐層縫合腹壁切口。術(shù)后即刻在股部皮下注射生理鹽水進(jìn)行抗休克處理,液體量為4 mL/100 g,回籠。對照組采用同樣方法開、關(guān)腹,但盲腸不結(jié)扎穿孔,也不留置導(dǎo)管。治療組于造模1 h后按100 mg/kg劑量給予姜黃素注射入腹腔,模型組及對照組注射同等劑量生理鹽水。

        1.2.2血清BUN、Scr水平及腎臟組織勻漿Nrf2蛋白水平 分別于造模后6、12、24及48 h麻醉大鼠,每組8只,麻醉后于大鼠左側(cè)第3、4肋間心尖搏動最強(qiáng)處針尖刺入采血,離心分離血清,采用日本Olympus AU400全自動生化分析儀測定血清BUN及Scr水平;開腹分離腎臟組織,腎臟組織置-80 ℃冰箱凍存、采用 Western blot法檢測Nrf2蛋白表達(dá)水平,用凝膠圖像處理系統(tǒng)將結(jié)果掃描成電子圖像,以條帶分析軟件Quantity One 4.4.0分析,計(jì)算出光密度值(OD值),用目標(biāo)帶與內(nèi)參照β-actin的光密度比值來衡量表達(dá)情況,作為Nrf2的相對表達(dá)量。

        1.2.3腎臟組織學(xué) 另取造模后12 h的腎臟組織用10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色,于光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織學(xué)變化,以炎癥細(xì)胞浸潤,腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性評估AKI損傷程度。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 血清BUN及Scr水平

        造模后6、12、24及48 h時(shí),與對照組同時(shí)點(diǎn)比較,模型組大鼠血清BUN及Scr水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組同時(shí)點(diǎn)比較,治療組大鼠血清BUN及Scr水平顯著降低(P<0.01);與對照組同時(shí)點(diǎn)比較,治療組大鼠血清BUN及Scr水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示造模1 h后給予姜黃素注射能改善膿毒癥大鼠腎功能。見表1。

        表1 3組大鼠造模后6、12、24及48 h時(shí)的血清BUN及Scr水平

        注:(1)與對照組同時(shí)點(diǎn)比較,P<0.01;(2)與模型組同時(shí)點(diǎn)比較,P<0.01;(3)與對照組同時(shí)點(diǎn)比較,P<0.01。

        2.2 腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白(OD值)

        造模后6、12、24及48 h時(shí),與對照組同時(shí)點(diǎn)比較,模型組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組同時(shí)點(diǎn)比較,治療組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與對照組同時(shí)點(diǎn)比較,治療組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

        2.3 腎臟組織學(xué)

        HE染色結(jié)果可見,造模后12 h 時(shí),對照組各時(shí)間段腎臟組織結(jié)構(gòu)正常,未見明 顯 病 理 變 化(圖1A)。模型組大鼠部分腎小球周圍間質(zhì)充血,可見腎小管水腫,腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血,炎癥細(xì)胞浸潤(圖1 B),而治療組小鼠腎小球及腎小管充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤情況較同時(shí)點(diǎn)模型組減輕(圖1C)。

        表2 3組大鼠造模后6、12、24及48 h時(shí)的腎臟勻漿組織中Nrf2蛋白水平比較

        注:(1)與對照組同時(shí)點(diǎn)比較,P<0.01;(2)與模型組同時(shí)點(diǎn)比較,P<0.01;(3)與對照組同時(shí)點(diǎn)比較,P<0.01。

        注:A為對照組,B為手術(shù)組, C為治療組。

        3 討論

        膿毒癥是由感染引起的嚴(yán)重的SIRS,其病理生理機(jī)制復(fù)雜且易受多種因素影響,目前缺乏有效的防治方法。膿毒癥在后期常發(fā)生多器官功能衰竭,肺臟、肝臟、胃腸道、腎臟以及血液系統(tǒng)常最先受累,據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),在被診斷為膿毒癥的患者中約有42%伴有不同程度的AKI,此類患者的死亡率高達(dá)74.5%,且有逐年上升的趨勢[6]。近幾年國外的很多研究均證明AKI時(shí)伴有氧化應(yīng)激的發(fā)生。Nrf2是近幾年來研究較多的細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,它通過協(xié)調(diào)誘導(dǎo)對抗氧化應(yīng)激蛋白和Ⅱ相解毒酶的的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),在機(jī)體防御外來侵襲、抵御毒性損害中起關(guān)鍵作用[7-8]。Nrf2含有6個不同的功能區(qū),被命名為Neh1-Neh6[9-10]。目前的研究證明Nrf2主要在代謝和解毒的組織中表達(dá),比如腎臟、肝臟,還有一些持續(xù)與外界壞境接觸的組織如皮膚、肺和消化道等[11-12]。生理狀態(tài)下,Nrf2與細(xì)胞質(zhì)中的果蠅肌動蛋白結(jié)合蛋白Kelch結(jié)合,抑制Nrf2的表達(dá),使其無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性,細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)[13]。當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后或在蛋白激酶C的作用下,Nrf-2與Keap1解耦聯(lián),轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,進(jìn)而與ARE啟動子部位結(jié)合,啟動下游靶基因的表達(dá),進(jìn)一步調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究中,在對照組大鼠腎臟組織中檢測出Nrf2,表明正常腎臟組織中存在Nrf2,模型組Nrf2水平較對照組明顯下降,其蛋白相對量先逐漸上升后期出現(xiàn)下降,提示膿毒癥損傷后強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷了機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng),致使Nrf2水平的下調(diào);同時(shí)膿毒癥產(chǎn)生的大量毒素作用于炎癥細(xì)胞,其產(chǎn)生的多種炎癥介質(zhì)在早期促使Nrf2入核反應(yīng)增加,Nrf2在腎臟組織中表達(dá)上調(diào),內(nèi)源性抗損傷能力增強(qiáng)。隨著膿毒癥損傷加重,大量蓄積的ROS導(dǎo)致氧化-還原失衡,組織、細(xì)胞損傷加重,Nrf2出核減少,機(jī)體抗氧化能力減弱,最終出現(xiàn)嚴(yán)重的器官功能損害。由此可見,Nrf2在膿毒癥抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮了重要作用,為臨床治療膿毒癥提供了新的思路,但其深入的作用機(jī)制,仍待進(jìn)一步研究。

        姜黃素(curcumin)最初是在1870年從姜黃中分離出來的一種相對分子質(zhì)量小的多酚類化合物,普遍認(rèn)為它是姜黃中最有效的成分,有著較為廣泛的藥理作用,研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在抗炎癥損傷、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血脂、抗病毒、抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用。姜黃素含有多個功能基團(tuán),包含2個酚羥基、2個不飽和酮雙鍵、1個中性活性亞甲基及1個β-二酮基,酚羥基和β-二酮是抗氧化活性部分。姜黃素中含有2個α、β不飽和羰基序列可能是激活Nrf2的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),有學(xué)者通過加氫還原該結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)可降低Nrf2的活化,同樣具有αβ不飽和羰基的15d-PGJ2與Dimethoxycurcumin也能激活Nrf2。本研究結(jié)果顯示,姜黃素干預(yù)后的膿毒癥大鼠,Nrf2水平較手術(shù)組明顯升高,腎小球及腎小管充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤顯著減輕,提示姜黃素可能通過Nrf2信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮氧化應(yīng)激作用,對腎臟起到保護(hù)的作用。研究報(bào)道,姜黃素可激活Nrf2核轉(zhuǎn)位,上調(diào)Nrf2水平,增加具有抗氧化作用的代謝酶合成,減輕細(xì)胞活性氧族/活性氮族水平,發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能。姜黃素還可抑制脂質(zhì)過氧化,維持和/或增強(qiáng)各種抗氧化酶的活力,包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GPx)等。楊開艷等[14]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能提高脂多糖激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中SOD和GPx的活性,有效的清除氧自由基;有學(xué)者在對大鼠腎組織氧化應(yīng)激損害的研究中發(fā)現(xiàn),姜黃素不僅可以降低大鼠血漿和腎組織中丙二醛(MDA)的含量,還可以提高GSH含量和GPx的活力,改善腎組織的氧化應(yīng)激損傷[15-17]。姜黃素在發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的同時(shí),也表現(xiàn)一定程度的促氧化作用。姜黃素這一作用主要是通過過氧化物酶系統(tǒng)產(chǎn)生苯氧基團(tuán),后者協(xié)同氧化細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽或NADH,在細(xì)胞攝入O2時(shí)產(chǎn)生ROS[18-20]。Sandur等[21]證實(shí)姜黃素的這種雙向作用與其在體內(nèi)的藥物濃度有關(guān),兩者之間可以相互轉(zhuǎn)化;Hatcher等[22]也證實(shí)了同樣的看法,并進(jìn)一步指出姜黃素是一個自由基清除劑和氫供體,具有雙重活性。

        綜上,姜黃素具有多種藥理作用,但具體機(jī)制至今尚未完全闡明,本研究從Nrf2的氧化應(yīng)激作用研究了姜黃素對于膿毒癥所致腎臟損傷的保護(hù)作用,對膿毒癥在基因?qū)寡趸较虻难芯刻峁┬碌乃悸?。?dāng)然膿毒癥作為一個涉及多因素的復(fù)雜病理、生理過程,仍需全面、系統(tǒng)、多層次的研究,才能攻克這一難題。

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