楊挺， 俞慧， 黃偉

(江南大學(xué)附屬醫(yī)院 & 無錫市第三人民醫(yī)院 急診科， 江蘇 無錫 214000)

膿毒癥是機體對細菌感染作出過度反應(yīng)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，如不及時處理則進展為嚴重膿毒癥，出現(xiàn)膿毒癥休克、多器官功能衰竭，若合并急性腎損傷(AKI)時，死亡率可達70%[1]。膿毒癥AKI的發(fā)病機制目前仍未闡明，對AKI的研究早期主要集中于血流動力學(xué)或(和)炎癥因子方面，近幾年的研究證實氧化應(yīng)激反應(yīng)在膿毒癥過程中起著重要的作用。核因子相關(guān)因子(Nrf2)是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，Nrf2/ARE通路是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[2-3]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制備大鼠膿毒癥AKI模型，并應(yīng)用姜黃素進行干預(yù)治療，于造模后6、12、24及48 h時，檢測大鼠腎組織中Nrf2蛋白及血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平，探討姜黃素在膿毒癥AKI中的作用及機制，為膿毒癥AKI的臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1動物及試劑 清潔級雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量(260±20)g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供；AU400全自動生化分析儀購自日本olympus公司，尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 96只大鼠隨機均分為對照組、模型組、治療組。模型組和治療組大鼠參考文獻[4-5]采用CLP法制備膿毒癥AKI大鼠模型，造模前大鼠禁食12 h、禁水6 h，以3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定大鼠于操作臺，剪去腹部體毛、消毒后沿腹正中線皮膚開約2 cm切口，暴露腹腔臟器；找到盲腸游離盲端，取出盲腸，在距盲端1 cm處結(jié)扎，用18號針頭在近端及末端貫通穿刺2次，施壓于盲腸擠出少量腸內(nèi)分泌物于腹腔內(nèi)，放置1根直徑約0.5 cm的硬質(zhì)導(dǎo)管并固定，回納盲腸，逐層縫合腹壁切口。術(shù)后即刻在股部皮下注射生理鹽水進行抗休克處理，液體量為4 mL/100 g，回籠。對照組采用同樣方法開、關(guān)腹，但盲腸不結(jié)扎穿孔，也不留置導(dǎo)管。治療組于造模1 h后按100 mg/kg劑量給予姜黃素注射入腹腔，模型組及對照組注射同等劑量生理鹽水。

1.2.2血清BUN、Scr水平及腎臟組織勻漿Nrf2蛋白水平 分別于造模后6、12、24及48 h麻醉大鼠，每組8只，麻醉后于大鼠左側(cè)第3、4肋間心尖搏動最強處針尖刺入采血，離心分離血清，采用日本Olympus AU400全自動生化分析儀測定血清BUN及Scr水平；開腹分離腎臟組織，腎臟組織置-80 ℃冰箱凍存、采用 Western blot法檢測Nrf2蛋白表達水平，用凝膠圖像處理系統(tǒng)將結(jié)果掃描成電子圖像，以條帶分析軟件Quantity One 4.4.0分析，計算出光密度值(OD值)，用目標帶與內(nèi)參照β-actin的光密度比值來衡量表達情況，作為Nrf2的相對表達量。

1.2.3腎臟組織學(xué) 另取造模后12 h的腎臟組織用10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，于光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織學(xué)變化，以炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞空泡樣變性評估AKI損傷程度。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清BUN及Scr水平

造模后6、12、24及48 h時，與對照組同時點比較，模型組大鼠血清BUN及Scr水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組同時點比較，治療組大鼠血清BUN及Scr水平顯著降低(P<0.01)；與對照組同時點比較，治療組大鼠血清BUN及Scr水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示造模1 h后給予姜黃素注射能改善膿毒癥大鼠腎功能。見表1。

表1 3組大鼠造模后6、12、24及48 h時的血清BUN及Scr水平

注：(1)與對照組同時點比較，P<0.01；(2)與模型組同時點比較，P<0.01；(3)與對照組同時點比較，P<0.01。

2.2 腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白(OD值)

造模后6、12、24及48 h時，與對照組同時點比較，模型組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組同時點比較，治療組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與對照組同時點比較，治療組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.3 腎臟組織學(xué)

HE染色結(jié)果可見，造模后12 h 時，對照組各時間段腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見明 顯 病 理 變 化(圖1A)。模型組大鼠部分腎小球周圍間質(zhì)充血，可見腎小管水腫，腎小球毛細血管擴張、充血，炎癥細胞浸潤(圖1 B)，而治療組小鼠腎小球及腎小管充血水腫及炎癥細胞浸潤情況較同時點模型組減輕(圖1C)。

表2 3組大鼠造模后6、12、24及48 h時的腎臟勻漿組織中Nrf2蛋白水平比較

注：(1)與對照組同時點比較，P<0.01；(2)與模型組同時點比較，P<0.01；(3)與對照組同時點比較，P<0.01。

注：A為對照組，B為手術(shù)組， C為治療組。

3 討論

膿毒癥是由感染引起的嚴重的SIRS，其病理生理機制復(fù)雜且易受多種因素影響，目前缺乏有效的防治方法。膿毒癥在后期常發(fā)生多器官功能衰竭，肺臟、肝臟、胃腸道、腎臟以及血液系統(tǒng)常最先受累，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，在被診斷為膿毒癥的患者中約有42%伴有不同程度的AKI，此類患者的死亡率高達74.5%，且有逐年上升的趨勢[6]。近幾年國外的很多研究均證明AKI時伴有氧化應(yīng)激的發(fā)生。Nrf2是近幾年來研究較多的細胞抗氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，它通過協(xié)調(diào)誘導(dǎo)對抗氧化應(yīng)激蛋白和Ⅱ相解毒酶的的表達進行調(diào)節(jié)，在機體防御外來侵襲、抵御毒性損害中起關(guān)鍵作用[7-8]。Nrf2含有6個不同的功能區(qū)，被命名為Neh1-Neh6[9-10]。目前的研究證明Nrf2主要在代謝和解毒的組織中表達，比如腎臟、肝臟，還有一些持續(xù)與外界壞境接觸的組織如皮膚、肺和消化道等[11-12]。生理狀態(tài)下，Nrf2與細胞質(zhì)中的果蠅肌動蛋白結(jié)合蛋白Kelch結(jié)合，抑制Nrf2的表達，使其無法進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，細胞處于穩(wěn)定狀態(tài)[13]。當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后或在蛋白激酶C的作用下，Nrf-2與Keap1解耦聯(lián)，轉(zhuǎn)入細胞核，進而與ARE啟動子部位結(jié)合，啟動下游靶基因的表達，進一步調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，在對照組大鼠腎臟組織中檢測出Nrf2，表明正常腎臟組織中存在Nrf2，模型組Nrf2水平較對照組明顯下降，其蛋白相對量先逐漸上升后期出現(xiàn)下降，提示膿毒癥損傷后強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷了機體的內(nèi)源性保護系統(tǒng)，致使Nrf2水平的下調(diào)；同時膿毒癥產(chǎn)生的大量毒素作用于炎癥細胞，其產(chǎn)生的多種炎癥介質(zhì)在早期促使Nrf2入核反應(yīng)增加，Nrf2在腎臟組織中表達上調(diào)，內(nèi)源性抗損傷能力增強。隨著膿毒癥損傷加重，大量蓄積的ROS導(dǎo)致氧化-還原失衡，組織、細胞損傷加重，Nrf2出核減少，機體抗氧化能力減弱，最終出現(xiàn)嚴重的器官功能損害。由此可見，Nrf2在膿毒癥抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮了重要作用，為臨床治療膿毒癥提供了新的思路，但其深入的作用機制，仍待進一步研究。

姜黃素(curcumin)最初是在1870年從姜黃中分離出來的一種相對分子質(zhì)量小的多酚類化合物，普遍認為它是姜黃中最有效的成分，有著較為廣泛的藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在抗炎癥損傷、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血脂、抗病毒、抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用。姜黃素含有多個功能基團，包含2個酚羥基、2個不飽和酮雙鍵、1個中性活性亞甲基及1個β-二酮基，酚羥基和β-二酮是抗氧化活性部分。姜黃素中含有2個α、β不飽和羰基序列可能是激活Nrf2的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，有學(xué)者通過加氫還原該結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)可降低Nrf2的活化，同樣具有αβ不飽和羰基的15d-PGJ2與Dimethoxycurcumin也能激活Nrf2。本研究結(jié)果顯示，姜黃素干預(yù)后的膿毒癥大鼠，Nrf2水平較手術(shù)組明顯升高，腎小球及腎小管充血水腫及炎癥細胞浸潤顯著減輕，提示姜黃素可能通過Nrf2信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮氧化應(yīng)激作用，對腎臟起到保護的作用。研究報道，姜黃素可激活Nrf2核轉(zhuǎn)位，上調(diào)Nrf2水平，增加具有抗氧化作用的代謝酶合成，減輕細胞活性氧族/活性氮族水平，發(fā)揮細胞保護功能。姜黃素還可抑制脂質(zhì)過氧化，維持和/或增強各種抗氧化酶的活力，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GPx)等。楊開艷等[14]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能提高脂多糖激活的小膠質(zhì)細胞中SOD和GPx的活性，有效的清除氧自由基；有學(xué)者在對大鼠腎組織氧化應(yīng)激損害的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅可以降低大鼠血漿和腎組織中丙二醛(MDA)的含量，還可以提高GSH含量和GPx的活力，改善腎組織的氧化應(yīng)激損傷[15-17]。姜黃素在發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的同時，也表現(xiàn)一定程度的促氧化作用。姜黃素這一作用主要是通過過氧化物酶系統(tǒng)產(chǎn)生苯氧基團，后者協(xié)同氧化細胞內(nèi)谷胱甘肽或NADH，在細胞攝入O2時產(chǎn)生ROS[18-20]。Sandur等[21]證實姜黃素的這種雙向作用與其在體內(nèi)的藥物濃度有關(guān)，兩者之間可以相互轉(zhuǎn)化；Hatcher等[22]也證實了同樣的看法，并進一步指出姜黃素是一個自由基清除劑和氫供體，具有雙重活性。

綜上，姜黃素具有多種藥理作用，但具體機制至今尚未完全闡明，本研究從Nrf2的氧化應(yīng)激作用研究了姜黃素對于膿毒癥所致腎臟損傷的保護作用，對膿毒癥在基因?qū)寡趸较虻难芯刻峁┬碌乃悸贰．?dāng)然膿毒癥作為一個涉及多因素的復(fù)雜病理、生理過程，仍需全面、系統(tǒng)、多層次的研究，才能攻克這一難題。