彭建， 吳兆穎， 劉巍巍， 趙海， 朱貴明， 曾柱1,**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)工程研究中心， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550025； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)是導(dǎo)致醫(yī)院感染的主要機(jī)會性致病菌之一[1]，會引發(fā)如呼吸道系統(tǒng)感染、敗血癥、手術(shù)切口感染、泌尿生殖道感染、獲得性肺炎和繼發(fā)性腦膜炎等感染或炎癥[2-4]，發(fā)生這類感染的重癥患者，感染后死亡率高于35%[1]。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，各醫(yī)院分離的AB對亞胺培南的平均耐藥率已達(dá)到70.5%[5]，可見抗AB感染治療形勢十分嚴(yán)峻?？咕挠址Q為抗微生物肽，是生物機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[6-7]，相較于其他抗菌藥物具有來源廣、作用機(jī)制特別、抑菌效果好、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢[8-9]，但也存在天然提取收集難、化學(xué)合成成本高、大規(guī)模生產(chǎn)成藥技術(shù)不成熟的缺點(diǎn)[10]。本課題組前期從家蠅轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選得到一個新天蠶素分子Cecropin4(Cec4)、并成功化學(xué)合成，且證實(shí)了家蠅抗菌肽Cec4在體外對AB具有較好的抗菌活性[11]。雖然臨床上多數(shù)感染只用一種抗生素就能控制，但面對多重感染或者耐藥性較強(qiáng)的細(xì)菌，常常采取聯(lián)合用藥的方式[12-14]，抗菌肽與抗生素的聯(lián)合使用不僅能提高治療效果，減少單一抗菌藥物的使用量，還能減少耐藥菌株的出現(xiàn)幾率[15-16]。因而，本研究旨在通過抗菌肽Cec4分別與3種臨床常用抗AB類抗生素進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，探究抗菌肽和抗生素體外聯(lián)合作用于AB的效果及藥效關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1受試菌株 標(biāo)準(zhǔn)AB(ATCC19606)保存于貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，多重耐藥AB(檢驗(yàn)號4367661)、泛耐藥AB(檢驗(yàn)號4367992)均來自貴州某三甲醫(yī)院，三株菌株均用25%甘油重懸，于-80 ℃暗處保存。

1.1.2主要藥物和試劑 抗菌肽Cecropin4委托吉爾生化(上海)有限公司采用固相化學(xué)合成法合成，純度(HPLC)>95%。注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉(SCF)購自輝瑞制藥有限公司，注射用亞胺培南西司他丁鈉(IMP)購自美國默沙東制藥公司，注射用硫酸多黏菌素B購自Biosharp公司，Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基和Luria-bertani(LB)固體培養(yǎng)基均購自索萊寶公司。

1.1.3主要儀器 單面垂直流超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè))，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，Millipore 0.22 μm微孔濾器(美國)，PB203-E型電子精密天平(上海梅特勒托利多儀器公司)，Milli-Q超純水儀(法國Millipore PHarmacia公司)，高壓滅菌鍋(日本ALR)，超低溫冰箱(日本三洋公司)，96孔平板(Biosharp)，麥?zhǔn)媳葷醿x(上海昕瑞公司)，微量加樣器(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1抗菌肽Cec4及3種抗生素分別對AB的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)測定 根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法[17]測定抗菌肽Cec4、注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉(SCF)、注射用亞胺培南西司他丁鈉(IMP)和注射用硫酸多黏菌素B單用時對AB的MIC。將抗菌肽Cec4和SCF、IMP及PB干粉分別配制終濃度為10、100、100及10 g/L的儲備液，并將抗菌肽Cec4和抗生素雙倍比稀釋為不同質(zhì)量濃度的液體，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肕H培養(yǎng)基將復(fù)蘇并過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期的3株AB菌懸液濃度調(diào)整為1.5×108CFU/L。設(shè)置抗菌肽Cec4、SCF、IMP為實(shí)驗(yàn)組、多黏菌素B為陽性對照組、培養(yǎng)基為陰性對照組，在96孔板中加入同濃度的菌液和不同質(zhì)量濃度抗菌肽/抗生素，于37 ℃，120 r/min培養(yǎng)24 h。結(jié)果根據(jù)CLSI推薦的液體稀釋法的判定標(biāo)準(zhǔn)，MIC值為肉眼未見細(xì)菌生長所對應(yīng)的抗菌肽/抗生素濃度，之后各取0.01 mL樣本液涂布在LB固體平板上，于37 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h，無細(xì)菌生長所對應(yīng)的抗菌肽/抗生素濃度為最小殺菌濃度(MBC)，用以驗(yàn)證MIC的準(zhǔn)確性。

1.2.2抗菌肽Cec4與3種抗生素對AB的聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[18]方法改進(jìn)，采用肉湯稀釋棋盤法進(jìn)行試驗(yàn)。選取7×7棋盤，抗菌肽/抗生素藥液的制備與測定MIC時所用的方法一致。根據(jù)測得的每種藥物單用對每種菌株的MIC，將所有藥物的最高濃度設(shè)定為MIC的2倍，然后均用無菌蒸餾水對其進(jìn)行一系列雙倍比稀釋。用1.2.1的方法制備細(xì)菌懸液，以抗菌肽Cec4和SCF聯(lián)合使用作用于標(biāo)準(zhǔn)AB為例，SCF以橫列方式排布，抗菌肽Cec4以縱列方式排布，每孔中不同濃度的抗菌肽/抗生素藥液共計(jì)0.1 mL，然后每孔中再加入菌懸液0.1 mL。當(dāng)96孔板中的每一橫行抗菌肽Cec4濃度保持不變時，SCF濃度依次為2、1、1/2、1/4、1/8、1/16及0倍MIC；當(dāng)每一縱列孔中SCF濃度保持不變時，Cec4濃度依次為2、1、1/2、1/4、1/8、1/16及0倍MIC。將96孔板振蕩均勻后放在濕盒中，于37 ℃下靜置培養(yǎng)18 h。

1.2.3聯(lián)合用藥效果判定 部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index, FIC index)是抗菌藥藥效學(xué)參數(shù)之一，F(xiàn)IC index=[MIC(a)/MICa] +[MIC(b)/MICb]，其中MIC(a)和MIC(b)分別代表a藥和b藥聯(lián)合用藥時各自的MIC值，MICa和MICb分別代表a藥和b藥單用時的MIC值。當(dāng)FIC index≤0.5時，藥物a和b之間有協(xié)同抗菌作用；當(dāng)0.52.0時，則認(rèn)為藥物a和b之間有拮抗作用，且2種藥物聯(lián)合使用的效果顯著低于其中一種藥物單獨(dú)使用的效果。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽Cec4及3種抗生素對AB體外的抗菌活性

抗菌肽Cec4對標(biāo)準(zhǔn)、多重耐藥和泛耐藥AB的MIC均為4 mg/L，而SCF和IMP對標(biāo)準(zhǔn)AB的MIC均是抗菌肽Cec4的4倍，SCF和IMP對多重耐藥AB的MIC均為抗菌肽Cec4的16倍，對泛耐藥AB的MIC也都是抗菌肽Cec4的8倍，說明AB對抗菌肽Cec4比對SCF、IMP抗生素更敏感；PB對3株AB的抑菌活性均較好，MIC為0.625 mg/L(表1)。

表1 抗菌肽Cec4及3種抗菌藥對AB的MIC

2.2 抗菌肽Cec4分別與3種抗生素聯(lián)合使用對3株AB的藥敏試驗(yàn)

2.2.1對標(biāo)準(zhǔn)AB的藥敏試驗(yàn) 抗菌肽Cec4分別與SCF、IMP聯(lián)合作用于標(biāo)準(zhǔn)AB時，F(xiàn)IC index在0.75～1.00，均表現(xiàn)為相加作用。Cec4與PB聯(lián)合作用于標(biāo)準(zhǔn)AB時，Cec4對標(biāo)準(zhǔn)AB的MIC降至1 mg/L，PB對標(biāo)準(zhǔn)AB的MIC降至0.156 mg/L，Cec4和PB聯(lián)用時的MIC均為單用時的1/4，抑菌效果增強(qiáng)，其FIC index為0.50，表現(xiàn)為協(xié)同作用(表2)。

表2 抗菌肽Cec4分別與3種抗生素聯(lián)用對標(biāo)準(zhǔn)AB藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2對多重耐藥AB的藥敏試驗(yàn) 抗菌肽Cec4與SCF聯(lián)用時，F(xiàn)IC index是1；抗菌肽Cec4與IMP聯(lián)用時，Cec4的MIC降至0.5 mg/L，IMP的MIC降至單用時的1/2、FIC index為0.625；抗菌肽Cec4與PB聯(lián)用時，Cec4的MIC降至0.5 mg/L，PB的MIC降至0.312 mg/L，是單用時的1/2，抑菌效果增強(qiáng)， FIC index為0.625。因此，抗菌肽Cec4與這3種抗生素聯(lián)合使用時均表現(xiàn)為相加作用(表3)。

表3 抗菌肽Cec4分別與3種抗生素聯(lián)用對多重耐藥AB的藥敏試驗(yàn)

2.2.3對泛耐藥AB的藥敏試驗(yàn) 抗菌肽Cec4分別與SCF、IMP聯(lián)用時，抗菌肽和這2種抗生素的MIC均降為單用時MIC的1/2，抗菌效果增強(qiáng)；抗菌肽Cec4與PB聯(lián)用時，Cec4對泛耐藥AB的MIC為2 mg/L，是單用時的1/2，而PB對泛耐藥AB的MIC變?yōu)閱斡脮r的1/8，表明泛耐藥AB對Cec4和PB的敏感性均增強(qiáng)，F(xiàn)IC index為0.625。此試驗(yàn)說明抗菌肽Cec4分別與這3種抗生素聯(lián)合作用于泛耐藥AB時，均表現(xiàn)為相加作用(表4)。

表4 抗菌肽Cec4分別與3種抗生素聯(lián)用對泛耐藥AB的藥敏試驗(yàn)

3 討論

碳青霉烯類藥物在過去10年中被認(rèn)為是治療革蘭陰性耐藥菌感染的最后一道防線。近年來，碳青霉烯類AB檢出率快速上升，已成為當(dāng)前臨床抗感染治療面臨的巨大難題。傳統(tǒng)抗生素抗菌機(jī)制主要是針對細(xì)菌代謝通路或特定靶點(diǎn)，極易產(chǎn)生耐藥。因此，尋找新的抗菌策略成為亟待解決的問題[19-20]。由于抗菌肽主要是通過靜電力與細(xì)胞膜或者細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相互作用，具有廣譜抗菌能力，因而抗菌肽受到科研人員的廣泛關(guān)注[21]。前期研究表明抗菌肽Cec4在體外對AB的MIC僅為4 mg/L，遠(yuǎn)低于目前研究較多的抗菌肽LL-37在體外對AB的MIC[22]，說明AB對抗菌肽Cec4具有較高的敏感性。

在本研究中，抗菌肽Cec4單用時對AB的MIC均小于注射用SCF、IMP這2種抗生素，抗菌肽Cec4的抑菌效果較強(qiáng)。在聯(lián)合用藥試驗(yàn)中，抗菌肽Cec4與PB聯(lián)合作用于標(biāo)準(zhǔn)AB時，抗菌肽Cec4的MIC值為單用時的1/4，多黏菌素B的MIC也僅為單用時的1/4，抗菌能力明顯增強(qiáng)，F(xiàn)IC index為0.50，表現(xiàn)為協(xié)同作用；抗菌肽Cec4和SCF聯(lián)合作用于標(biāo)準(zhǔn)AB時，F(xiàn)IC index為1.00，表現(xiàn)為相加作用，和IMP聯(lián)合作用于標(biāo)準(zhǔn)AB時表現(xiàn)為相加作用，F(xiàn)IC index是0.75。SCF和IMP單用時對多重耐藥AB的MIC均高達(dá)64 mg/L，對泛耐藥AB的MIC為32 mg/L，這2株AB對這兩種抗生素均表現(xiàn)出耐藥[23]。但當(dāng)抗菌肽Cec4與這兩種抗生素聯(lián)合作用于多重耐藥和泛耐藥AB時，這兩種抗生素的MIC均為單用時最小抑菌濃度的1/2，表現(xiàn)為相加作用，敏感性增強(qiáng)，由此可推斷Cec4聯(lián)合抗生素使用可以有效清除該類耐藥細(xì)菌。此外，抗菌肽Cec4在分別與SCF、IMP和PB聯(lián)合作用于多重耐藥AB時，F(xiàn)IC index范圍為0.625～1.000，均表現(xiàn)出相加抗菌作用。已有研究表明大蒜素聯(lián)合兩種臨床抗菌藥物作用于多重耐藥AB[24]時的FIC index范圍為0.31～1.50，其中23.3%表現(xiàn)為無關(guān)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)的聯(lián)合用藥效果更為明顯，說明抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)用有較好的臨床前景。

綜上，由于抗菌肽Cec4對臨床常見的革蘭陰性菌具有良好的抗菌效果，與3種臨床常用抗革蘭陰性菌抗生素聯(lián)用呈相加、協(xié)同抑菌作用，抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合用藥有望降低臨床抗菌藥用量、毒副反應(yīng)及細(xì)菌的耐藥性。