胡穎， 羅俊， 張晴， 葉蘭， 胡曉燕， 鄭濤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院， 貴州 貴陽 550025； 4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽 550001)

子宮肌瘤起源于子宮平滑肌細(xì)胞，多見于30～50歲女性，發(fā)病率高達(dá)20%～25%，是女性生殖器中最常見的良性腫瘤，也是未絕經(jīng)婦女行子宮全切術(shù)的最主要原因，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康[1-3]。目前多采用激素類藥物治療子宮肌瘤，但副作用大，停藥后易復(fù)發(fā)，治療效果并不理想[4～6]，因此臨床上采用中藥輔助治療子宮肌瘤，取得了較滿意的療效[7-8]。婦科再造丸(Fu Ke Zai Zao pill，F(xiàn)KW)系貴州名醫(yī)王聘賢所創(chuàng)，至今已有70多年的歷史，具有活血化瘀、行氣止痛、益氣健脾之功效，臨床廣泛用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、體虛帶下和婦科炎癥等婦科疾病，對(duì)子宮肌瘤癥狀亦具有緩解作用。本課題組前期研究顯示FKW對(duì)于雌、孕激素誘發(fā)的大鼠子宮平滑肌瘤樣增生有顯著的抑制作用，并能促進(jìn)體外培養(yǎng)人子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡[9-13]。有研究表明，細(xì)胞凋亡調(diào)控基因表達(dá)異常是子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一，其中B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族起著重要的作用[14]，然而目前FKW促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究通過血清藥理學(xué)方法，觀察FKW對(duì)體外培養(yǎng)人體子宮肌瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax表達(dá)的影響，探討FKW促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用增加新的適應(yīng)癥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 選擇2015年1月-2017年4月因子宮肌瘤行子宮全切或肌瘤剔除術(shù)的患者4例，35～50歲，未絕經(jīng)，術(shù)前3個(gè)月無類固醇激素使用史，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)診斷為子宮肌瘤。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)3月齡Sprague Dawley(SD)大鼠，雌性，體質(zhì)量(200±20)g，合格證號(hào)SCXK(黔)2012-0001，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3藥物、主要試劑與儀器 FKW(棕褐色丸劑，2.6 g/10丸，貴陽德昌祥藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20151021)，桂枝茯苓膠囊(Gui Zhi Fu Lin capsule, GZFL，連云港康緣制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)150106)；Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，二甲基亞砜和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體和兔抗人Bax單克隆抗體(美國CST公司)，單克隆兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體和兔抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(英國Abcam公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，QL-901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，Mini型蛋白電泳系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)及LG2000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.4標(biāo)本及藥品制備 術(shù)中無菌條件下取子宮肌瘤組織1 cm3，加入3%雙抗(青、鏈霉素)的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)10 mL ，冰浴密閉盡快送入細(xì)胞培養(yǎng)室。FKW試驗(yàn)前用蒸餾水配制成高劑量組藥液(終濃度112 g/L)，再依次稀釋配制成中、低劑量組藥液(終濃度分別為56、28 g/L)；GZFL臨用前用蒸餾水配制成濃度為30 g/L混懸液。

1.2 方法

1.2.1給藥和制備血清 取SD大鼠60只，隨機(jī)分為空白組(無藥血清組)、FKW低劑量組(28 g/L)、中劑量FKW組(56 g/L)、高劑量FKW組(112 g/L)及GZFL組，每組12只。無藥血清組大鼠每次灌服生理鹽水10 mL/kg，F(xiàn)KW高、中、低劑量組每次灌服相應(yīng)藥液10 mL/kg(分別為成人等效劑量12.9倍、6.5倍、3.2倍)，GZFL組每次灌服混懸液10 mL/kg(為成人等效劑量6.4倍)。各組大鼠給藥2次/d，間隔6 h，連續(xù)2 d，第3天末次給藥1 h后股動(dòng)脈取血，分離血清，56 ℃、30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人子宮肌瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[15]無菌條件下用3%雙抗PBS液漂洗肌瘤組織，眼科剪將標(biāo)本剪碎為1 mm3組織塊，間距2～3 mm擺放于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，吸出培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)瓶翻正培養(yǎng)，每2～3天換液1次，約3～4周出現(xiàn)致密細(xì)胞層后取出組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)、傳代，傳代細(xì)胞均經(jīng)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-actin)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定證實(shí)。

1.2.3Western Blot檢測人子宮肌瘤細(xì)胞中Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為無藥血清組(加入20%無藥血清)、FKW低、中、高劑量組及GZFL組(加入20%含藥血清)。收集經(jīng)藥物干預(yù)72 h的各組子宮肌瘤細(xì)胞，PBS洗滌2次，裂解液冰上常規(guī)裂解30 min，12 000 r/min離心20 min，加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，行SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，常溫下浸于5%脫脂牛奶，水平搖床上封閉2 h后加入一抗(鼠抗人Bcl-2單克隆抗體1 ∶1 000，兔抗人Bax單克隆抗體1 ∶1 000，單克隆兔抗GAPDH抗體1 ∶1 000)，4 ℃搖床上孵育過夜，含吐溫-20 ℃的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)洗滌PVDF膜5 min×6次，加入1 ∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜5 min×6次，用ECL顯色試劑盒顯色，PVDF膜放入Bio-Rad圖像攝取系統(tǒng)，保存圖像。用LG2000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶光密度分析，計(jì)算目的蛋白吸光度與GAPDH吸光度的比值，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣本重復(fù)測量3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

人子宮肌瘤細(xì)胞培養(yǎng)至第7～10天組織塊邊緣開始有細(xì)胞游出，隨著時(shí)間延長細(xì)胞逐漸分裂，最終融合成片；胞體細(xì)長，為梭形或不規(guī)則三角形，呈放射狀或旋渦狀生長，當(dāng)細(xì)胞生長接近鋪滿瓶底80%時(shí)傳代，傳代周期約3～5 d，傳至3～5代的細(xì)胞形態(tài)均一，生長良好，經(jīng)α-actin單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)，陽性細(xì)胞數(shù)接近100%，說明培養(yǎng)的肌瘤細(xì)胞純度較高，符合要求，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)觀察。見圖1。

注：箭頭處為肌瘤細(xì)胞(棕黃色)

2.2 子宮肌瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與無藥血清組比較，F(xiàn)KW含藥血清各劑量組均能增加Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量，降低Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05或P<0.01)，且作用隨劑量的增加有增強(qiáng)的趨勢(shì)(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

注：與無藥血清組比較,(1)P<0.01，(2)P<0.05；與FKW低劑量組比較,(3)P<0.01，(4)P<0.05；與FKW中劑量組比較，(5)P<0.01，(6)P<0.05。

3 討論

腫瘤是細(xì)胞增殖和死亡均發(fā)生了異常的疾病[16]。實(shí)體腫瘤細(xì)胞的死亡主要有壞死和凋亡兩種形式，一般認(rèn)為，細(xì)胞凋亡抑制在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中比細(xì)胞過度增殖起的作用更為重要[17]。細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞在凋亡基因調(diào)控下發(fā)生的細(xì)胞自我消亡的過程，是一種主動(dòng)的、固有的程序化現(xiàn)象[18]。細(xì)胞凋亡一旦受到抑制，這部分通過“非法途徑”得以存活的細(xì)胞將持續(xù)異?！鞍l(fā)展”，進(jìn)而形成局在型腫物[19]。研究表明，Bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用[20]。Bcl-2家族成員含有1～4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，現(xiàn)已至少發(fā)現(xiàn)19個(gè)同源物，根據(jù)蛋白在細(xì)胞凋亡中的功能可將Bcl-2家族分為兩類：一類是抗凋亡的，如Bcl-2、Bcl-xl、Ced-9、Mcl-1等，另一類是促凋亡的，如Bax、Bcl-xs、Bak、Bad等[21]。其中，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最具代表性的功能相互對(duì)立的凋亡調(diào)控基因[22]。Bcl-2來源于B細(xì)胞淋巴瘤，被發(fā)現(xiàn)于B 細(xì)胞濾泡性淋巴瘤染色體斷裂點(diǎn)，是凋亡抑制基因，在細(xì)胞中高表達(dá)時(shí)可對(duì)抗細(xì)胞凋亡、延長細(xì)胞壽命，故亦被稱為“長壽基因”；Bcl-2蛋白是一種膜蛋白，位于線粒體膜，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜上，可通過抗氧化通路、影響Ca2+內(nèi)流等多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡[23]。Bax與Bcl-2有21%的同源性，主要的生物學(xué)功能是加速細(xì)胞凋亡，具有抑制腫瘤作用，Bax編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成二聚體來發(fā)揮作用[24]。二者結(jié)合可形成Bcl-2/Bcl-2、Bcl-2/Bax和Bax/Bax 三種二聚體形式，其中同二聚體Bax/Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bcl-2則抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)二者形成異二聚體Bcl-2/Bax時(shí)，Bax與Bcl-2就會(huì)相互對(duì)抗、彼此制約，因此二者對(duì)細(xì)胞凋亡形成正負(fù)調(diào)控，各自在細(xì)胞內(nèi)所占的比例是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因素[25]。子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白在子宮肌瘤標(biāo)本中強(qiáng)陽性表達(dá)，在正常子宮肌層中弱陽性表達(dá)；Bax蛋白在正常子宮肌層中強(qiáng)陽性表達(dá)，在子宮肌瘤標(biāo)本弱陽性表達(dá)，Bcl-2/Bax在子宮肌瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常[26-27]。因此，Bax表達(dá)水平過低、Bcl-2表達(dá)水平過高是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。

本研究成功建立人子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)并傳代，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)觀察，結(jié)果顯示FKW含藥血清各劑量組作用72 h后，子宮肌瘤細(xì)胞Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，與無藥血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且作用隨劑量的增加有增強(qiáng)的趨勢(shì)(P<0.05或P<0.01)，提示FKW促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的作用與Bcl-2家族密切相關(guān)，即FKW可上調(diào)Bcl-2家族中抗凋亡成員Bcl-2的表達(dá)并降低促凋亡成員Bax的表達(dá)，從而Bax/Bax結(jié)合的同二聚體減少，Bcl-2/Bax結(jié)合的異二聚體相對(duì)增多，進(jìn)而對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)正調(diào)控。FKW是否還具有Bcl-2家族外的調(diào)控機(jī)制促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡，還有待進(jìn)一步深入研究。此外，由于FKW由42味中藥組成，組方及作用機(jī)制復(fù)雜，藥理活性的發(fā)揮可能是源于FKW組方中特有的成分，也可能是各組分相互作用后的產(chǎn)物，或者是其在體內(nèi)復(fù)雜的藥物代謝過程中所產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，其具體發(fā)揮效應(yīng)的成分亦有待進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，F(xiàn)KW可通過影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡，抑制肌瘤生長。