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        婦科再造丸含藥血清對人子宮肌瘤細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響*

        2019-11-06 06:21:18胡穎羅俊張晴葉蘭胡曉燕鄭濤
        關(guān)鍵詞:無藥單克隆二聚體

        胡穎, 羅俊, 張晴, 葉蘭, 胡曉燕, 鄭濤

        (1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 機能學(xué)實驗室, 貴州 貴陽 550025; 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院, 貴州 貴陽 550025; 4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 貴州 貴陽 550001)

        子宮肌瘤起源于子宮平滑肌細胞,多見于30~50歲女性,發(fā)病率高達20%~25%,是女性生殖器中最常見的良性腫瘤,也是未絕經(jīng)婦女行子宮全切術(shù)的最主要原因,嚴(yán)重威脅著女性的身心健康[1-3]。目前多采用激素類藥物治療子宮肌瘤,但副作用大,停藥后易復(fù)發(fā),治療效果并不理想[4~6],因此臨床上采用中藥輔助治療子宮肌瘤,取得了較滿意的療效[7-8]。婦科再造丸(Fu Ke Zai Zao pill,F(xiàn)KW)系貴州名醫(yī)王聘賢所創(chuàng),至今已有70多年的歷史,具有活血化瘀、行氣止痛、益氣健脾之功效,臨床廣泛用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、體虛帶下和婦科炎癥等婦科疾病,對子宮肌瘤癥狀亦具有緩解作用。本課題組前期研究顯示FKW對于雌、孕激素誘發(fā)的大鼠子宮平滑肌瘤樣增生有顯著的抑制作用,并能促進體外培養(yǎng)人子宮肌瘤細胞的凋亡[9-13]。有研究表明,細胞凋亡調(diào)控基因表達異常是子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一,其中B細胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族起著重要的作用[14],然而目前FKW促進子宮肌瘤細胞凋亡相關(guān)機制的研究尚未見報道。因此,本研究通過血清藥理學(xué)方法,觀察FKW對體外培養(yǎng)人體子宮肌瘤細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax表達的影響,探討FKW促進子宮肌瘤細胞凋亡可能的作用機制,為臨床應(yīng)用增加新的適應(yīng)癥提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1標(biāo)本來源 選擇2015年1月-2017年4月因子宮肌瘤行子宮全切或肌瘤剔除術(shù)的患者4例,35~50歲,未絕經(jīng),術(shù)前3個月無類固醇激素使用史,術(shù)后經(jīng)病理學(xué)診斷為子宮肌瘤。

        1.1.2實驗動物 清潔級3月齡Sprague Dawley(SD)大鼠,雌性,體質(zhì)量(200±20)g,合格證號SCXK(黔)2012-0001,由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

        1.1.3藥物、主要試劑與儀器 FKW(棕褐色丸劑,2.6 g/10丸,貴陽德昌祥藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號20151021),桂枝茯苓膠囊(Gui Zhi Fu Lin capsule, GZFL,連云港康緣制藥股份有限公司生產(chǎn),批號150106);Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),胎牛血清(美國Hyclone公司),二甲基亞砜和胰蛋白酶(美國Sigma公司),鼠抗人Bcl-2單克隆抗體和兔抗人Bax單克隆抗體(美國CST公司),單克隆兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體和兔抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(英國Abcam公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司),QL-901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠),Mini型蛋白電泳系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)及LG2000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)。

        1.1.4標(biāo)本及藥品制備 術(shù)中無菌條件下取子宮肌瘤組織1 cm3,加入3%雙抗(青、鏈霉素)的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)10 mL ,冰浴密閉盡快送入細胞培養(yǎng)室。FKW試驗前用蒸餾水配制成高劑量組藥液(終濃度112 g/L),再依次稀釋配制成中、低劑量組藥液(終濃度分別為56、28 g/L);GZFL臨用前用蒸餾水配制成濃度為30 g/L混懸液。

        1.2 方法

        1.2.1給藥和制備血清 取SD大鼠60只,隨機分為空白組(無藥血清組)、FKW低劑量組(28 g/L)、中劑量FKW組(56 g/L)、高劑量FKW組(112 g/L)及GZFL組,每組12只。無藥血清組大鼠每次灌服生理鹽水10 mL/kg,F(xiàn)KW高、中、低劑量組每次灌服相應(yīng)藥液10 mL/kg(分別為成人等效劑量12.9倍、6.5倍、3.2倍),GZFL組每次灌服混懸液10 mL/kg(為成人等效劑量6.4倍)。各組大鼠給藥2次/d,間隔6 h,連續(xù)2 d,第3天末次給藥1 h后股動脈取血,分離血清,56 ℃、30 min滅活,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2人子宮肌瘤細胞的原代培養(yǎng)及鑒定[15]無菌條件下用3%雙抗PBS液漂洗肌瘤組織,眼科剪將標(biāo)本剪碎為1 mm3組織塊,間距2~3 mm擺放于培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi),吸出培養(yǎng)液,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)瓶翻正培養(yǎng),每2~3天換液1次,約3~4周出現(xiàn)致密細胞層后取出組織塊,繼續(xù)培養(yǎng)、傳代,傳代細胞均經(jīng)α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-actin)免疫細胞化學(xué)法鑒定證實。

        1.2.3Western Blot檢測人子宮肌瘤細胞中Bax、Bcl-2的蛋白表達 實驗分為無藥血清組(加入20%無藥血清)、FKW低、中、高劑量組及GZFL組(加入20%含藥血清)。收集經(jīng)藥物干預(yù)72 h的各組子宮肌瘤細胞,PBS洗滌2次,裂解液冰上常規(guī)裂解30 min,12 000 r/min離心20 min,加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液,100 ℃煮沸5 min,行SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,常溫下浸于5%脫脂牛奶,水平搖床上封閉2 h后加入一抗(鼠抗人Bcl-2單克隆抗體1 ∶1 000,兔抗人Bax單克隆抗體1 ∶1 000,單克隆兔抗GAPDH抗體1 ∶1 000),4 ℃搖床上孵育過夜,含吐溫-20 ℃的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBST)洗滌PVDF膜5 min×6次,加入1 ∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,室溫孵育2 h,PBST洗膜5 min×6次,用ECL顯色試劑盒顯色,PVDF膜放入Bio-Rad圖像攝取系統(tǒng),保存圖像。用LG2000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進行條帶光密度分析,計算目的蛋白吸光度與GAPDH吸光度的比值,作為目的蛋白的相對表達水平。每個樣本重復(fù)測量3次。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 人子宮肌瘤細胞原代培養(yǎng)及鑒定

        人子宮肌瘤細胞培養(yǎng)至第7~10天組織塊邊緣開始有細胞游出,隨著時間延長細胞逐漸分裂,最終融合成片;胞體細長,為梭形或不規(guī)則三角形,呈放射狀或旋渦狀生長,當(dāng)細胞生長接近鋪滿瓶底80%時傳代,傳代周期約3~5 d,傳至3~5代的細胞形態(tài)均一,生長良好,經(jīng)α-actin單克隆抗體免疫細胞化學(xué)染色證實,陽性細胞數(shù)接近100%,說明培養(yǎng)的肌瘤細胞純度較高,符合要求,可用于后續(xù)的實驗觀察。見圖1。

        注:箭頭處為肌瘤細胞(棕黃色)

        2.2 子宮肌瘤細胞Bax、Bcl-2蛋白表達

        實驗結(jié)果顯示,與無藥血清組比較,F(xiàn)KW含藥血清各劑量組均能增加Bax蛋白相對表達量,降低Bcl-2蛋白相對表達量(P<0.05或P<0.01),且作用隨劑量的增加有增強的趨勢(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

        注:與無藥血清組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05;與FKW低劑量組比較,(3)P<0.01,(4)P<0.05;與FKW中劑量組比較,(5)P<0.01,(6)P<0.05。

        3 討論

        腫瘤是細胞增殖和死亡均發(fā)生了異常的疾病[16]。實體腫瘤細胞的死亡主要有壞死和凋亡兩種形式,一般認為,細胞凋亡抑制在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中比細胞過度增殖起的作用更為重要[17]。細胞凋亡是有核細胞在凋亡基因調(diào)控下發(fā)生的細胞自我消亡的過程,是一種主動的、固有的程序化現(xiàn)象[18]。細胞凋亡一旦受到抑制,這部分通過“非法途徑”得以存活的細胞將持續(xù)異?!鞍l(fā)展”,進而形成局在型腫物[19]。研究表明,Bcl-2基因家族在細胞凋亡的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用[20]。Bcl-2家族成員含有1~4個同源結(jié)構(gòu)域,現(xiàn)已至少發(fā)現(xiàn)19個同源物,根據(jù)蛋白在細胞凋亡中的功能可將Bcl-2家族分為兩類:一類是抗凋亡的,如Bcl-2、Bcl-xl、Ced-9、Mcl-1等,另一類是促凋亡的,如Bax、Bcl-xs、Bak、Bad等[21]。其中,Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最具代表性的功能相互對立的凋亡調(diào)控基因[22]。Bcl-2來源于B細胞淋巴瘤,被發(fā)現(xiàn)于B 細胞濾泡性淋巴瘤染色體斷裂點,是凋亡抑制基因,在細胞中高表達時可對抗細胞凋亡、延長細胞壽命,故亦被稱為“長壽基因”;Bcl-2蛋白是一種膜蛋白,位于線粒體膜,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜上,可通過抗氧化通路、影響Ca2+內(nèi)流等多種機制抑制細胞凋亡[23]。Bax與Bcl-2有21%的同源性,主要的生物學(xué)功能是加速細胞凋亡,具有抑制腫瘤作用,Bax編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成二聚體來發(fā)揮作用[24]。二者結(jié)合可形成Bcl-2/Bcl-2、Bcl-2/Bax和Bax/Bax 三種二聚體形式,其中同二聚體Bax/Bax促進細胞凋亡,Bcl-2/Bcl-2則抑制細胞凋亡,當(dāng)二者形成異二聚體Bcl-2/Bax時,Bax與Bcl-2就會相互對抗、彼此制約,因此二者對細胞凋亡形成正負調(diào)控,各自在細胞內(nèi)所占的比例是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要因素[25]。子宮肌瘤的發(fā)病機制與細胞凋亡關(guān)系密切[14]。研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2蛋白在子宮肌瘤標(biāo)本中強陽性表達,在正常子宮肌層中弱陽性表達;Bax蛋白在正常子宮肌層中強陽性表達,在子宮肌瘤標(biāo)本弱陽性表達,Bcl-2/Bax在子宮肌瘤組織中的表達顯著高于正常[26-27]。因此,Bax表達水平過低、Bcl-2表達水平過高是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。

        本研究成功建立人子宮肌瘤細胞原代培養(yǎng)并傳代,可用于后續(xù)的實驗觀察,結(jié)果顯示FKW含藥血清各劑量組作用72 h后,子宮肌瘤細胞Bax蛋白相對表達量增加,Bcl-2蛋白相對表達量降低,與無藥血清組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),且作用隨劑量的增加有增強的趨勢(P<0.05或P<0.01),提示FKW促進子宮肌瘤細胞凋亡的作用與Bcl-2家族密切相關(guān),即FKW可上調(diào)Bcl-2家族中抗凋亡成員Bcl-2的表達并降低促凋亡成員Bax的表達,從而Bax/Bax結(jié)合的同二聚體減少,Bcl-2/Bax結(jié)合的異二聚體相對增多,進而對子宮肌瘤細胞凋亡實現(xiàn)正調(diào)控。FKW是否還具有Bcl-2家族外的調(diào)控機制促進子宮肌瘤細胞凋亡,還有待進一步深入研究。此外,由于FKW由42味中藥組成,組方及作用機制復(fù)雜,藥理活性的發(fā)揮可能是源于FKW組方中特有的成分,也可能是各組分相互作用后的產(chǎn)物,或者是其在體內(nèi)復(fù)雜的藥物代謝過程中所產(chǎn)生的代謝物質(zhì),其具體發(fā)揮效應(yīng)的成分亦有待進行進一步深入研究。

        綜上所述,F(xiàn)KW可通過影響細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達,促進子宮肌瘤細胞凋亡,抑制肌瘤生長。

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