劉金河， 葛章文， 張望明， 晏文濤， 劉志， 吳昌學

(1. 貴州醫(yī)科大學 細胞工程生物醫(yī)藥技術國家地方聯(lián)合工程實驗室 組織工程與干細胞實驗中心 貴州省再生醫(yī)學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004; 2.中國醫(yī)學科學院 成體干細胞轉化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州省人民醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550002； 4.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550001; 5.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

肺癌在我國癌癥的發(fā)病率和死亡率中均居首位，近年來發(fā)病呈升高趨勢[1]。非小細胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，約占肺癌的80%，該類型的肺癌早期特征不明顯，確診時往往已是中晚期，且術后的轉移率較高，5年生存率僅為20%[2-3]。目前，肺癌的化療主要采用鉑類藥物，如順鉑或卡鉑，但多次使用后會出現(xiàn)耐藥性，并且患者化療后生活質量較差。因此，尋找其他行之有效的藥物及治療途徑對肺癌治療就有著至關重要的意義[4]。二氫楊梅素(dihydromyricetin, DMY)是一種黃酮類化合物，主要存在于楊梅科、柳科、葡萄科及藤黃科等植物中，在藤茶屬植物中含量最高[5-6]。最近的研究表明，DMY具有廣泛的藥理活性，能夠通過促進細胞凋亡、多環(huán)節(jié)阻滯及延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展來抑制腫瘤的擴散[7-8]；DMY還通過下調semaphorin 4D蛋白表達來抑制結直腸癌的發(fā)展[9]，通過激活PI3K/Akt/ FoxO3a信號通路來阻止人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的氧化損傷[10]；臨床上，DMY也能緩解地塞米松造成的肌肉萎縮[11]。但DMY對肺癌A549細胞作用的研究相對較少，本研究采用不同濃度的DMY處理肺癌A549細胞，觀察處理后A549細胞的增殖及凋亡情況，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1細胞、藥物和試劑 人肺癌A549 細胞株購自上海中國科學院細胞研究所，0.25%胰酶、青霉素、鏈霉素、EDTA、PBS、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司，動物細胞凋亡DNA Ladder抽提試劑盒購自碧云天生物有限公司，DMY購自上海源葉生物公司，MTT、Hoechst 33342/PI雙染試劑盒購自北京鼎國生物有限公司。

1.1.2主要儀器 Mode l550酶標儀購自美國BIO-RAD公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Cellstar公司，低溫高速離心機購自德國HeraeusSepateeh公司，BHZ-RFL-T3熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取肺癌A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基當中，置于5% CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；細胞生長融合度為80%時，用0.25% 胰蛋白酶消化，隔天換液、傳代，取對數(shù)生長期的A549 細胞進行后續(xù)研究。

1.2.2DMY對肺癌A549細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的肺癌A549細胞分為1、5、10、15、20 mg/L DMY組(分別加入相應量DMY處理細胞)及對照組(加入等量DMSO處理細胞)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，加入5 g/L MTT ，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清液后，每孔加入二甲基亞砜150 μL，避光孵育10 min 后放在酶標儀上測定各孔在490 nm 處的吸光度值，計算細胞抑制率[4],同時計算DMY 對A549細胞的半數(shù)致死量(IC50值)；選取IC50值附近濃度的 DMY 處理細胞, 分別在24、48及72 h時，采用MTT進行細胞存活率檢測[8]，實驗重復3次。

1.2.3DMY誘導肺癌A549細胞的凋亡 取對數(shù)生長期的A549細胞以5×104個/孔接種于6孔板內，置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細胞分為DMY組及對照組，DMY組加入終濃度大約為IC50值的DMY，對照組加入等量DMSO，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h、胰酶消化，預冷的 PBS 洗滌 2 次，Hoechst33342和PI各 5 μL，混勻后4 ℃下避光孵育 25 min，PBS清洗后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4DMY對A549細胞中DNA的影響 參照Li等[11]的實驗方法，采用DNA ladder凝膠電泳觀察A549細胞中DNA變化，取對數(shù)生長期的A549細胞分為DMY組及對照組，DMY組加入終濃度大約為IC50值的DMY，對照組加入等量DMSO，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，胰酶消化，PBS清洗后，離心去上清，收集細胞，提取細胞內的DNA，2%的瓊脂糖凝膠跑膠后凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 DMY抑制肺癌A549細胞增殖

MTT結果顯示，DMY 作用 A549 細胞72 h時，對 A549 細胞具有顯著的殺傷作用，細胞抑制率隨著 DMY 濃度的增加逐漸增高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 當濃度達到20 mg/L時，DMY 對 A549 細胞增殖的抑制率高達86%(圖1A)，進一步計算可知IC50值為(13.16±0.098)mg/L。選取接近IC50值的 DMY 濃度(15 mg/L DMY)處理A549細胞，分別在24、48及72 h時進行細胞存活率檢測，結果顯示在處理72 h內，細胞存活率隨著時間的延長逐漸降低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1B。

注：A為不同濃度DMY處理肺癌A549細胞72 h，與對照組比較， (1)P<0.05，(2)P<0.01；B為15 mg/L DMY與肺癌A549細胞作用不同時間，與對照組比較， (1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.2 DMY促進肺癌A549細胞凋亡

用 Hoechst 33342/PI 染色觀察 DMY 誘導 A549 細胞的凋亡，對照組 A549 細胞用染色劑染色后，熒光顯微鏡下可見細胞核呈現(xiàn)彌散均勻的淡藍色熒光；采用15 mg/L DMY 處理A549細胞 48 h 時，熒光顯微鏡下可見細胞核呈現(xiàn)致密的強藍色熒光，并且染色質凝集，提示這些細胞處于凋亡狀態(tài)。見圖2。

圖2 對照組和15 mg/L DMY 處理組肺癌 A549 細胞凋亡情況(Hoechst 33342/PI，×400)

2.3 DMY誘導肺癌A549細胞DNA斷裂

用DNA ladder試劑盒檢測DMY對A549細胞DNA的影響，對照組細胞DNA電泳成一條條帶，未出現(xiàn)Ladder現(xiàn)象；15 mg/L DMY處理48 h時，A549細胞中凋亡 DNA 小片段增加，出現(xiàn)Ladder現(xiàn)象。見圖3。

注：對照組DNA未見梯狀條帶，1號泳道代表DMY(15 mg/L)。

3 討論

肺癌在所有癌癥的發(fā)病率中居于首位，并且具有臨床表現(xiàn)不明顯，治療效果差的特征。我國人口眾多，肺癌發(fā)病率居高不下，新發(fā)病例和死亡人數(shù)均超過全球的1/3，且發(fā)病率還在逐年增加[12]。目前的研究顯示，肺癌的發(fā)病機制尚未闡明，成為提高治療效果和改善預后的主要障礙。

近年有研究顯示， DMY 不僅在體外對人乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等多種腫瘤細胞有抑制作用[13-16], 活體條件下 DMY 也可以顯著抑制人肝癌 Bel-7402 裸鼠移植瘤的生長[17]。在皮膚鱗狀細胞癌及神經(jīng)膠質瘤細胞中，DMY 能誘導相關信號通路啟動細胞自噬死亡程序[18-19]。DMY 作為一種黃酮類化合物，不僅具有廣泛的抗腫瘤活性還具有其他藥理學活性，其在抗菌[20]、抗神經(jīng)炎癥[21]、抗肝細胞[22]及心肌損傷[23]等方面具有顯著的效果，最近的研究還發(fā)現(xiàn)其對睡眠的改善也有一定的作用[24]。DMY在藤茶屬植物中含量最高，并且在國內分布廣泛、取材容易、價格合理，若能開發(fā)為抗腫瘤藥物，成藥后價格便宜，具有先天的優(yōu)勢。

綜上所述，本研究中采用DMY干預肺癌 A549 細胞，發(fā)現(xiàn)DMY能抑制細胞增殖，并且很小劑量時就具有極顯著的效果，且具有濃度及時間依賴性(P<0.01)。15 mg/L的DMY干預 肺癌A549 細胞 48 h后，細胞進入凋亡狀態(tài)，DNA ladder顯示細胞中的基因組 DNA 不同程度被打斷，說明DMY能夠通過引起 A549 細胞內DNA的程序性斷裂而促進細胞凋亡。由此可見，DMY 對肺癌 A549細胞增殖有良好抑制效果，在治療肺癌方面具有較大的臨床研究價值。