胡 晶，劉 潔，徐冰雁，戴 娜，胡 梅，周芳亮,4，史紅健，羅晶婧2,，藺 婷，何迎春2,,4

(湖南中醫(yī)藥大學 1. 研究生學院、2. 中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室、3. 醫(yī)學院、4. 湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208；5. 長沙醫(yī)學院中醫(yī)學院，湖南 長沙 410219)

益氣解毒方是本課題組長期研究的一個復方，由黃芪、黃連、白花蛇舌草、黨參、天花粉、茯苓、甘草組成，能夠明顯改善鼻咽癌患者的氣虛體質(zhì)，有效緩解放化療帶來的不良反應(yīng)。大量研究表明，益氣解毒方水提物能有效抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移，誘導細胞凋亡，但其作用機制尚待進一步探討。研究表明，MAPK/ERK信號通路參與腫瘤細胞多種生物學行為，呈現(xiàn)異常高表達狀態(tài)[1]。我們前期的研究表明，益氣解毒方水提物可以通過下調(diào)MAPK/ERK信號通路關(guān)鍵蛋白的表達，阻滯細胞周期，抑制人鼻咽癌CNE2細胞的增殖[2]。那么，它是否能夠抑制MAPK/ERK信號通路的活化，從而發(fā)揮誘導鼻咽癌細胞凋亡的效應(yīng)，是本課題研究的重點。本實驗以人鼻咽癌CNE1、CNE2細胞為研究對象，用不同濃度益氣解毒方水提物干預，觀察細胞增殖和凋亡情況，檢測CNE1、CNE2細胞中生存凋亡相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、Bcl-2、Bax及MAPK/ERK信號通路關(guān)鍵蛋白的表達，初步探討益氣解毒方水提物誘導人鼻咽癌細胞凋亡的分子機制，以期為擴大其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株人鼻咽癌細胞CNE1(高分化)、CNE2(低分化)，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，本實驗室傳代培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑益氣解毒方藥物組成及水提物的制備主要參考廖雪等[3]的制備方法。RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；DMSO(Amresco公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；Hoechst 33342(翊圣生物科技有限公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)(北京索萊寶)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(BD公司)；MAPK/ERK信號通路蛋白檢測盒(CST公司)；抗體Survivn、XIAP、Bax、Bcl-2(CST公司)。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱賀利氏HERAcell 150i(賽默飛世爾公司)；ELX800全自動酶標分析儀、CytationTM5細胞成像多功能檢測系統(tǒng)(BioTek公司)；5415R高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；熒光倒置光學顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS公司)；熒光雙染流式細胞儀Cellometer Image Cytometer(K2)(Nexcelom公司)；Odyssey-CLX雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(Gene有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)鼻咽癌CNE1、CNE2細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，適時傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗[2]。

2.2 CCK-8法檢測細胞活性分組如下：對照組(Control)、益氣解毒方提取物(Yiqi Jiedu Formula extract,YQ)組(0.125、0.25、0.5、1.0 g·L-1)、順鉑組(cisplatin，Cis) 4.0 mg·L-1。取對數(shù)生長期的細胞，常規(guī)消化，制成每100 μL含3 000個細胞的懸液，種于96孔板中，待細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)5個復孔。分別于24、48、72 h后，棄原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL CCK-8溶液，孵育1.5 h后，于酶標儀測450 nm處檢測吸光度[2]。重復3次。

2.3 Hoechst 33342染色法觀察細胞凋亡形態(tài)分組如下：Control、YQ(0.25、0.5、1.0 g·L-1)、Cis 4.0 mg·L-1。取對數(shù)生長期CNE1、CNE2細胞，常規(guī)消化后，種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度益氣解毒方水提物，每個濃度設(shè)置3次復孔。處理48 h后，用PBS洗滌2次，每孔加入1 mL 10 mg·L-1的Hoechst 33342染色液，置于培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，再用PBS洗滌3次，于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。重復3次。

2.4 線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)檢測細胞凋亡分組同“2.3”。取對數(shù)生長期CNE1、CNE2細胞，常規(guī)消化后種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度益氣解毒方水提物，每個濃度設(shè)置3次復孔。處理48 h后，用PBS洗滌2次，吸凈殘留的PBS后，加入1 mL細胞培養(yǎng)液，再加入1 mL JC-10染色工作液，充分混勻后，在細胞培養(yǎng)箱中靜置孵育20 min；同時配制一定體積的JC-10染色緩沖液，置于冰浴盒中；培養(yǎng)箱孵育完成后，用配制好的JC-10染色緩沖液清洗2次，吸凈殘留的染色緩沖液后，加入2 mL細胞培養(yǎng)液，于Cytation 5觀察拍照。重復3次。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率分組同“2.3”。取對數(shù)生長期CNE1、CNE2細胞，常規(guī)消化后種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁長至50%后，加入不同濃度益氣解毒方水提物，每個濃度設(shè)置3個重復。處理48 h后，用PBS洗滌2次，吸凈殘留的PBS后，胰蛋白酶(不含EDTA)消化，制成單細胞懸液，收集細胞離心，用PBS洗滌2次，將約1×106個細胞移入離心管中，再次離心收集細胞，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，分別加入5 μL FITC和PI，混勻后避光染色15 min，再加100 μL 1×Binding Buffer終止；取20 μL細胞懸液上機檢測。30 min內(nèi)用流式細胞儀檢測凋亡。重復3次。

2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達分組同“2.3”。取對數(shù)生長期CNE1、CNE2細胞，常規(guī)消化后種于培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，加入不同濃度益氣解毒方水提物，每個濃度設(shè)置3個重復。處理48 h后，用PBS洗滌2次，吸凈殘留的PBS后加入細胞裂解液，冰上裂解30 min。并測定藥物組蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、敷抗體、顯影[2]。檢測β-actin、Survivin、XIAP、Bcl-2、Bax、p-c-Raf、p-MEK、p-ERK1/2的表達情況。目的蛋白相對表達量=目的蛋白/β-actin，重復3次。

3 結(jié)果

3.1 益氣解毒方對鼻咽癌細胞活性的影響Fig 1的CCK-8檢測結(jié)果顯示，不同濃度益氣解毒方水提物分別處理CNE1、CNE2細胞24、48、72 h后，與對照組相比，CNE1、CNE2細胞的增殖均受到抑制，且隨著濃度和時間的增加，其抑制作用更加明顯(P<0.05)。

3.2 益氣解毒方對鼻咽癌細胞凋亡的影響

3.2.1Hoechst 33342染色觀察鼻咽癌細胞形態(tài) 如Fig 2所示，對照組的細胞核呈均勻一致的淡藍色；不同濃度益氣解毒方水提物處理后的細胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征，即部分細胞核呈顆粒狀亮藍色，同時伴有細胞核的邊集、碎裂、皺縮等，且熒光強度逐漸增加；順鉑處理后，細胞核熒光強度增強，有明顯的凋亡。對各組熒光強度進行半定量分析，與對照組相比，不同濃度藥物組的熒光強度明顯增加。

3.2.2JC-10檢測鼻咽癌細胞膜電位 如Fig 3所示，對照組CNE1、CNE2細胞經(jīng)JC-10染色后，顯示紅色熒光；不同濃度益氣解毒方水提物處理后，CNE1、CNE2細胞出現(xiàn)不同程度的綠色熒光，說明細胞線粒體膜電位下降。用ImageJ對紅綠熒光進行光密度分析，并計算各自所占總光密度的比值，結(jié)果顯示，益氣解毒方水提物可以誘導鼻咽癌細胞凋亡。

Fig 1 Inhibition of YQ on proliferation of CNE1(A) and CNE2(B) cells by CCK-8 n=3)*P<0.05 vs control

Fig 2 Effect of YQ on apoptosis morphology of CNE1 andCNE2 cells by Hoechst 33342(scale bar=100 μm)
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.2.3流式細胞術(shù)檢測鼻咽癌細胞凋亡率 經(jīng)熒光雙染流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)(Fig 4)，不同濃度益氣解毒方水提物作用于CNE1、CNE2細胞48 h后，與對照組相比，益氣解毒方水提物各濃度組，CNE1、CNE2細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，提示益氣解毒方水提物可以明顯促進CNE1、CNE2細胞凋亡。

3.3 益氣解毒方對鼻咽癌細胞生存凋亡相關(guān)蛋白及MAPK/ERK信號通路蛋白表達的影響如Fig 5所示，與對照組比較，益氣解毒方水提物各濃度組CNE1和CNE2細胞的生存蛋白Survivin、XIAP、抗凋亡蛋白Bcl-2表達均降低，促凋亡蛋白Bax表達上升，MAPK/ERK信號通路關(guān)鍵蛋白p-c-Raf、p-MEK、p-ERK1/2表達明顯下降，且差異都具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 3 Effect of YQ on apoptosis of CNE1 and CNE2 cells by JC-10 (scale bar=100 μm)*P<0.05, **P<0.01 vs control

3.4 MAPK/ERK信號通路在益氣解毒方誘導鼻咽癌細胞凋亡中的影響在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了進一步驗證益氣解毒方水提物是否通過干預MAPK/ERK信號通路發(fā)揮誘導凋亡作用，課題組選擇鼻咽癌CNE2細胞，加入該通路的激活劑和抑制劑。Fig 6結(jié)果顯示，與單用益氣解毒方水提物組相比，加入激活劑ISO處理CNE2細胞48 h，特異性激活MAPK/ERK信號通路后，關(guān)鍵蛋白p-c-Raf、p-MEK、p-ERK1/2的表達量相對上升；而加入該通路抑制劑PD98059處理CNE2細胞48 h后，該信號通路受到抑制，關(guān)鍵蛋白的表達量均相對下降。同時，加入激活劑ISO和益氣解毒方水提物處理CNE2細胞48 h后，與單用益氣解毒方水提物相比，其誘導細胞CNE2凋亡的效應(yīng)降低(Fig 7)。

4 討論

鼻咽癌是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤，多發(fā)生在我國南方地區(qū)[4]，其病因可能與EB病毒感染、環(huán)境、遺傳等因素有關(guān)[5-6]。目前治療以放化療為主[7]，患者5年生存率為40%～60%，并且存在放療不敏感、化療耐藥等不良反應(yīng)，所以如何減輕不良反應(yīng)，是臨床治療中面臨的較為棘手的問題。而我國有采用中藥治療鼻咽癌的案例，中藥及復方可明顯減輕放化療后副作用，提高機體免疫功能，起到增效減毒的作用[8-10]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，益氣解毒方聯(lián)合同期的放化療可以明顯提高鼻咽癌患者的免疫力和生存率，減輕放化療毒副反應(yīng)[11-12]。

細胞的生長情況決定于細胞增殖與凋亡之間的動態(tài)平衡，MAPK/ERK信號通路是細胞內(nèi)重要的促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的經(jīng)典通路，主要是通過調(diào)控該通路下游的細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白和細胞生存凋亡相關(guān)蛋白的活性，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡。該通路的異常激活與鼻咽癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。我們前期的研究顯示，益氣解毒方可以明顯抑制鼻咽癌細胞的增殖，可以阻滯細胞于G2/M期，發(fā)揮抑瘤作用。

*P<0.05vscontrol

MAPK/ERK信號通路在益氣解毒方抑制CNE2細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，而誘導細胞凋亡也是藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑，那么益氣解毒方是否通過抑制該通路的活化誘導細胞凋亡，值得進一步研究。隨著對腫瘤發(fā)生機制的進一步研究，發(fā)現(xiàn)凋亡在腫瘤疾病中非常關(guān)鍵。從某種角度來說，凋亡不正?？梢詫е录毎脑鲋钞惓14]。所以，如何促使細胞凋亡是腫瘤防治的熱點和難點，能否有效地促進細胞凋亡，也是抗腫瘤能力評價的關(guān)鍵指標。目前，針對細胞凋亡的檢測方法主要有細胞的形態(tài)觀察、Hoechst 33342細胞核染色法、TUNEL染色法、線粒體膜電位檢測、AnnexinV-FITC/PI染色法、電鏡等[15]。本研究主要選取了CNE1、CNE2兩株細胞，分別采用Hoechst 33342染色法觀察細胞核的形態(tài)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)檢測細胞凋亡、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測凋亡情況。Hoechst 33342染色法、JC-10染色法和流式細胞術(shù)的結(jié)果均顯示益氣解毒方能誘導鼻咽癌細胞凋亡。

有研究表明，異?；罨腅RK可以上調(diào)Bcl-2家族抗凋亡成員Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1的表達，從而達到抑制凋亡，促進腫瘤細胞生存的作用；并且ERK還可以通過抑制促凋亡蛋白Bad和Bim的表達，發(fā)揮抗凋亡作用。Korfi等[16]運用MEK抑制劑聯(lián)合Bcl-2家族抑制劑誘導細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)合效果主要是促凋亡因子Bim磷酸化介導的。本實驗主要觀察驗證益氣解毒方作用于人鼻咽癌細胞后，MAPK/ERK信號通路在細胞凋亡中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，益氣解毒方作用于人鼻咽癌細胞后，細胞增殖受到抑制，且作用48 h細胞出現(xiàn)明顯凋亡，細胞生存蛋白Survivin、XIAP、抗凋亡蛋白Bcl-2表達均降低，而促凋亡蛋白Bax表達上升，MAPK/ERK信號通路關(guān)鍵蛋白p-c-Raf、p-MEK、p-ERK1/2的表達均明顯下調(diào)，即抑制MAPK/ERK信號通路活化。益氣解毒方對人鼻咽癌CNE1、CNE2細胞的增殖抑制效應(yīng)和凋亡誘導效果基本平行。在此基礎(chǔ)上，為了進一步明確MAPK/ERK信號通路在益氣解毒方誘導人鼻咽癌細胞凋亡中的作用，我們選擇CNE2細胞株，加入該通路的激活劑和抑制劑，活化和阻斷通路。加入激活劑后，p-c-Raf、p-MEK、p-ERK1/2的表達量相對上升，而加入抑制劑后，關(guān)鍵蛋白的表達量相對下降。同時，在該信號通路活化后，生存蛋白Survivin、XIAP、抗凋亡蛋白Bcl-2表達量上升，促凋亡蛋白Bax表達下降，而通路阻斷后，生存蛋白Survivin、XIAP、抗凋亡蛋白Bcl-2表達量則下降，促凋亡蛋白Bax表達上升。與直接加水提物比較，先加激活劑ISO再加水提物組p-c-Raf、p-MEK、p-ERK1/2的表達量明顯升高，XIAP、Survivn和Bcl-2表達量亦升高，而Bax表達量則相對降低。根據(jù)Western blot結(jié)果，課題組再次驗證其凋亡效應(yīng)，用流式細胞術(shù)檢測分別加入MAPK/ERK信號通路激活劑、抑制劑、先加激活劑再加水提物、只加YQ水提物0.5 g·L-1干預CNE2細胞48 h后，CNE2細胞的凋亡率。結(jié)果顯示，加入激活劑后，CNE2細胞存在生理情況下的凋亡，加入抑制劑后，CNE2細胞的凋亡率接近80%，YQ水提物組凋亡率在50%左右，而先加激活劑再加水提物組，CNE2細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，即益氣解毒方誘導凋亡的效應(yīng)被明顯削弱，表明MAPK/ERK信號通路在益氣解毒方誘導凋亡中發(fā)揮重要的作用。抑制MAPK/ERK信號通路的活化，下調(diào)Survivin、XIAP、Bcl-2的表達，上調(diào)Bax的表達，是益氣解毒方誘導人鼻咽癌細胞凋亡效應(yīng)的重要機制之一。

Fig 5 Survival and apoptotic protein and MAPK/ERK signaling pathway key protein expression level in CNE1 (A) and CNE2 (B) cells n=3)*P<0.05 vs control

Fig 6 Related protein expression level in CNE2 by MAPK/ERK signaling pathway activator and inhibitor n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsYQ group

綜上所述，本實驗證實了益氣解毒方水提物能夠誘導人鼻咽癌細胞凋亡，抑制增殖。研究結(jié)果表明，益氣解毒方水提物主要通過抑制MAPK/ERK信號通路，抑制關(guān)鍵蛋白p-c-Raf、p-MEK、p-ERK1/2的表達，下調(diào)Survivin、XIAP、Bcl-2的表達，上調(diào)Bax的表達，來誘導人鼻咽癌細胞凋亡。所以，抑制MAPK/ERK信號通路的活化，是益氣解毒方發(fā)揮抗鼻咽癌作用的重要機制之一，MAPK/ERK信號通路在益氣解毒方誘導鼻咽癌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

Fig 7 Effect of MAPK/ERK signaling pathway activator and inhibitor on YQ induced apoptosis n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsYQ group