王 翠，郭童林，沈麗霞

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿、進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病。AD的病因和發(fā)病非常復(fù)雜，至今仍未明確，淀粉級(jí)聯(lián)假說(shuō)認(rèn)為，β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)在大腦皮層的堆積是AD早期病理發(fā)生的關(guān)鍵，并最終導(dǎo)致AD其它的病理表現(xiàn)[1]。此外，Aβ的沉積是tau蛋白病變的上游機(jī)制，在Aβ引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，tau蛋白代謝異常是引起神經(jīng)元功能退化，甚至凋亡的重要原因之一[2]。其中，糖原合成酶激酶-3β(glycogen snythase kinase 3β，GSK-3β)是主要的tau蛋白激酶，并且與tau蛋白的異常磷酸化聯(lián)系最為密切，參與機(jī)體多個(gè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是PI3K/Akt信號(hào)通路的下游分子[3]。PI3K/Akt信號(hào)通路具有磷酸化GSK-3αSer-21、GSK-3βSer-9的作用，磷酸化GSK-3β可以引起促細(xì)胞存活基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活[4]。近年來(lái)研究表明，雌激素不僅調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育，而且參與AD的病理生理過(guò)程，發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。雌激素不僅能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，也能與細(xì)胞膜上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)、G蛋白偶聯(lián)受體30結(jié)合，激活PI3K和MAPK信號(hào)通路[6]。因此，GSK-3β以及相關(guān)的PI3K/Akt信號(hào)通路已成為以tau蛋白病理學(xué)為特征的神經(jīng)退行性疾病的早期診斷和治療的重要靶點(diǎn)。

為避免雌激素長(zhǎng)期應(yīng)用引起的不良反應(yīng)，植物雌激素受到廣泛關(guān)注。許多研究顯示，植物雌激素能與細(xì)胞膜及細(xì)胞核內(nèi)的ER結(jié)合，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、抗氧化和抗凋亡作用[7-8]。課題組以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，槲皮素(quercetin，Que)對(duì)原代培養(yǎng)的初生大鼠海馬和皮層神經(jīng)元具有雌激素樣保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)以Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷為模型，通過(guò)ER介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討槲皮素雌激素樣保護(hù)作用的分子機(jī)制，進(jìn)而探索植物雌激素替代雌激素作為AD治療性藥物的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12，高分化型)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物與試劑 槲皮素(純度98%，批號(hào)：100081-200907)、金雀異黃素(純度99.1%，批號(hào)：111704-201302)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；17β-雌二醇(Abcam公司，批號(hào)：APN11282-1-1)；Aβ25-35(Sigma公司，批號(hào)：A4559)；ER拮抗劑ICI182,780(Abcam公司，批號(hào)ab120131)；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司，批號(hào)：SH30284.01)；四季青無(wú)噬菌體低內(nèi)毒素特級(jí)胎牛血清(浙江天杭科技公司，批號(hào)：11011-8611)；MTT(Biosharp生物科技公司，批號(hào)：BS030A)；β-actin抗體(Santa Cruz公司，批號(hào)：SC47778)；抗體ERα(批號(hào)：ab32063)、ERβ(批號(hào)：ab3576)、p-Akt(Ser473)(批號(hào)：ab81283)、total-Akt(批號(hào)：ab32505)，均購(gòu)自Abcam公司；抗體p-GSK-3β(Ser9)(批號(hào)：5558S)；GSK-3β(批號(hào)：12456T)，購(gòu)自CST公司；IRDye 680RD羊抗鼠二抗(批號(hào)：926-68170)、IRDye 800CW羊抗兔二抗(批號(hào)：827-08365)，均購(gòu)自O(shè)dyssey公司；Alexa Fluor?594羊抗兔二抗(Abcam公司，批號(hào)：ab150080)。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；倒置顯微鏡(Nikon公司)；超速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；Cytation5細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)儀(BioTek公司)；Odyssey CLy紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR公司)；FV3000共聚焦激光掃描顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞用無(wú)酚紅的DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、0.1 g·L-1的鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

1.2.2.1Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷模型的建立 將細(xì)胞以8×107·L-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基，加入不同濃度的Aβ25-35(終濃度1、5、10、20、30 μmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.2.2不同濃度Que對(duì)PC12細(xì)胞的影響 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、Que組(終濃度1.25、2.5、5、10、20、40、50、60、80、100、200 μmol·L-1)，加藥培養(yǎng)24 h，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.2.3不同藥物對(duì)細(xì)胞損傷模型的影響 本課題組及其他研究結(jié)果均已證實(shí)[9-10]，17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)與金雀異黃素(genistein，Gen)均可以對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇17β-E2與Gen作為陽(yáng)性對(duì)照藥。實(shí)驗(yàn)分組為：正常對(duì)照組、模型組(Aβ25-3520 μmol·L-1)、17β-E2 0.1 μmol·L-1組、Gen 50 μmol·L-1組、Que組(40、60、80 μmol·L-1)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。同時(shí)，設(shè)置ER拮抗劑ICI182,780組，將終濃度為1 μmol·L-1的ICI182,780在培養(yǎng)箱中預(yù)孵育1 h，然后棄去培養(yǎng)基，按照正常對(duì)照組、Aβ25-35組、Que組、ICI組、ICI+Que組分別給藥。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)ERα和ERβ的表達(dá) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以2×108·L-1的密度接種到激光共聚焦專用的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按照“1.2.2.3”的分組分別加藥培養(yǎng)24 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，依次用4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1% TritonX-100透化液室溫下處理細(xì)胞10 min，5%牛血清白蛋白室溫作用細(xì)胞2 h，分別加入一抗ERα(1 ∶200)、ERβ(1 ∶200)4 ℃過(guò)夜，根據(jù)一抗性質(zhì)加入Cy3標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶500，PBST稀釋)，室溫避光孵育1 h，滴加DAPI染色液避光作用15 min，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，激光共聚焦顯微鏡下觀察，采集圖像，使用Image-Pro Plus6.0軟件分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞以6×108·L-1的密度，每皿加入6 mL細(xì)胞懸液，按照“1.2.2.3”的分組分別作用PC12細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，吸取上清，BCA法測(cè)定蛋白含量，95 ℃蛋白變性10 min。確保蛋白上樣量在30 μg以上，采用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，加入一抗β-actin、ERα和ERβ(1 ∶500)、p-Akt(1 ∶1 000)、total-Akt(1 ∶2 000)、p-GSK-3β(1 ∶500)、total-GSK-3β(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜4次，每次5 min，室溫?fù)u床孵育熒光二抗1 h(1 ∶15 000)，TBST洗膜4次，每次5 min，紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷模型的鑒定Fig 1的MTT結(jié)果顯示，Aβ25-35(1、5、10、20、30 μmol·L-1)作用細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率逐漸降低，與濃度呈正相關(guān)，表明細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Aβ25-35作用PC12細(xì)胞24 h的半數(shù)致死濃度(IC50)為27.34 μmol·L-1，故選擇20 μmol·L-1的Aβ25-35作用PC12細(xì)胞24 h，建立AD體外細(xì)胞損傷模型。

2.2 槲皮素對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷模型的影響本課題組前期研究結(jié)果表明，槲皮素濃度低于80 μmol·L-1時(shí)不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒性損傷，故選擇槲皮素(40、60、80 μmol·L-1)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，17β-雌二醇和金雀異黃素通過(guò)ER參與并激活其它信號(hào)途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，故選擇其為陽(yáng)性對(duì)照藥，MTT結(jié)果顯示，0.1 μmol·L-1的17β-E2和50 μmol·L-1Gen與Aβ25-35共同作用細(xì)胞的存活率最高，故用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照藥給藥劑量。低、中、高濃度的槲皮素與Aβ25-35共同作用細(xì)胞24 h后，17β-E2(0.1 μmol·L-1)組、Gen(50 μmol·L-1)組、Que(40、60、80 μmol·L-1)組與模型組相比，細(xì)胞存活率均明顯升高(P<0.05)，表明槲皮素可以保護(hù)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷(Fig 2A)。為進(jìn)一步探討這種保護(hù)作用是否通過(guò)ER發(fā)揮作用，同時(shí)加入ICI182,780(1 μmol·L-1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Que(60 μmol·L-1)組細(xì)胞的存活率明顯高于模型組(P<0.01)，Aβ+Que+ICI組與Aβ+Que組相比，能明顯抑制細(xì)胞的存活率(P<0.01)，表明槲皮素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用可被ER拮抗劑ICI182,780所拮抗(Fig 2B)。

Fig 1 Effect of Aβ25-35 on viability of PC12 cells n=4)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)ER表達(dá)免疫熒光染色結(jié)果表明(Fig 3)，與對(duì)照組相比，模型組ERα蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.01)；與模型組相比，17β-E2組、Gen組、Que(40、60、80 μmol·L-1)組中，ERα蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度明顯增加(P<0.01)。各組ERβ蛋白與模型組相比熒光強(qiáng)度均有所增加，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)Fig 4。

2.4 槲皮素對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 5、6結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組ERα、p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；陽(yáng)性藥物17β-E2組、Gen組和Que組均明顯上調(diào)了上述3種蛋白的表達(dá)量(P<0.01)，而模型組和不同給藥組對(duì)ERβ、total-Akt和total-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響并不明顯(P>0.05)。

Fig 2 Effect of quercetin on PC12 cells

A: Effect of different concentrations of quercetin on PC12 cells viability induced by Aβ25-35; B: Effect of quercetin on PC12 cells viability induced by ICI182,780.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAβ25-35;△△P<0.01vsAβ25-35+Que.

2.5 槲皮素與ICI182,780共同孵育后相關(guān)蛋白表達(dá)的變化如Fig 7所示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組total-Akt和total-GSK-3β蛋白表達(dá)基本無(wú)變化(P>0.05)。Aβ+Que組與模型組相比，p-Akt、p-GSK-3β蛋白水平明顯升高(P<0.01)；而Aβ+Que+ICI與Aβ+Que組相比，p-Akt、p-GSK-3β蛋白水平明顯降低(P<0.01)。提示槲皮素上調(diào)上述蛋白水平的作用可被ER抑制劑所拮抗。

3 討論

迄今為止，AD的病因和發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，普遍被認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制是β-淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)。研究認(rèn)為，Aβ沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，Aβ的神經(jīng)毒性是多種因素導(dǎo)致AD發(fā)病的共同通路[11-12]。PC12細(xì)胞廣泛用于神經(jīng)藥理學(xué)的體外實(shí)驗(yàn)研究，受神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)處理時(shí)間長(zhǎng)短或劑量大小影響，當(dāng)PC12細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，或NGF處理時(shí)間短或劑量小時(shí)，不表達(dá)ER蛋白，故本課題組選用高分化狀態(tài)的PC12細(xì)胞用于AD體外模型的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 20 μmol·L-1的Aβ25-35作用PC12細(xì)胞24 h時(shí)，細(xì)胞活力明顯降低，因此，用于建立AD體外損傷模型，探討槲皮素對(duì)AD發(fā)揮雌激素樣保護(hù)作用的分子機(jī)制。

Fig 3 ERα expression by immunofluorescence staining(×400)

A: Immunofluorescence staining of positive ERα protein; B: ERα mean fluorescent intensity.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAβ25-35.

Fig 4 ERβ expression by immunofluorescence staining(×400)

A: Immunofluorescence staining of positive ERβ protein; B: ERβ mean fluorescent intensity.

Fig 5 Effects of quercetin on ERα, ERβ protein expression in PC12 cells induced by Aβ25-35 n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAβ25-35

Fig 6 Effects of quercetin on expression of p-Akt, p-GSK-3β in PC12 cells induced by Aβ25-35 n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAβ25-35

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAβ25-35;△△P<0.01vsAβ25-35+Que

本實(shí)驗(yàn)用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與模型組相比，槲皮素藥物組與17β-雌二醇、金雀異黃素陽(yáng)性藥物組類似，在一定劑量范圍內(nèi)可以提高PC12細(xì)胞活性，初步驗(yàn)證了槲皮素的神經(jīng)保護(hù)作用。為探討槲皮素神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)與ER的關(guān)系，使用ER完全拮抗劑ICI182,780，其能夠阻斷雌激素類物質(zhì)通過(guò)ER介導(dǎo)的生物學(xué)活性。MTT結(jié)果表明，加入抑制劑預(yù)孵育細(xì)胞后，槲皮素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用受到明顯抑制。而細(xì)胞免疫熒光和Western blot的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以明顯提高ERα蛋白的表達(dá)，對(duì)于ERβ蛋白，槲皮素和模型組的蛋白表達(dá)量之間差異無(wú)顯著性；當(dāng)加入ICI182,780時(shí)，槲皮素的神經(jīng)保護(hù)作用減弱，表明槲皮素具有一定的雌激素樣作用，且可能是由ERα介導(dǎo)的。

植物雌激素同雌激素類似，除了在基因組作用下，與位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上的ER結(jié)合，與目標(biāo)基因啟動(dòng)子上的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element，ERE)結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)，還能與膜上ER結(jié)合，通過(guò)第二信使，激活一系列信號(hào)通路，間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，可以在幾秒到幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生快速的生物學(xué)效應(yīng)[13]。本研究表明，槲皮素不僅通過(guò)與ERα結(jié)合發(fā)揮雌激素樣神經(jīng)保護(hù)作用，還可快速激活細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Western blot結(jié)果顯示，槲皮素藥物組、17β-雌二醇和金雀異黃素陽(yáng)性藥物組p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達(dá)量明顯高于模型組。表明槲皮素可以拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，其機(jī)制為通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制下游靶分子GSK-3β活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。為進(jìn)一步探討ER與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系，使用工具藥ICI182,780干預(yù)PC12細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞中p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，當(dāng)ICI182,780存在時(shí)，上述蛋白的表達(dá)均被明顯抑制，表明槲皮素提高p-Akt、p-GSK-3β的表達(dá)可能有ER參與。因此，槲皮素通過(guò)經(jīng)典的ER通路及PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用，兩種途徑存在交叉和相互影響。

ER是核激素受體超家族成員，與DNA應(yīng)答元件結(jié)合的配體依賴型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。經(jīng)典的ER包含ERα和ERβ兩種亞型。有研究表明，植物雌激素具有類雌激素和/或抗雌激素活性的雙向作用，不同類型的植物雌激素與ER結(jié)合的親和力不同而表現(xiàn)出不同的作用效能，金雀異黃素等對(duì)ERβ親和力更強(qiáng)[14]。本課題組之前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素和槲皮素可以通過(guò)ER促進(jìn)MCF-7和T47D細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞分裂增殖指數(shù)，從而表現(xiàn)出雌激素樣活性。我們前期的研究也證實(shí)，與其他植物雌激素不同的是，槲皮素對(duì)海馬或皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用主要是通過(guò)ERα受體介導(dǎo)的。綜上所述，通過(guò)雌激素耗竭條件下建立穩(wěn)定的AD體外損傷模型，證實(shí)槲皮素具有雌激素樣作用，對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用，其通過(guò)經(jīng)典的ER途徑，影響PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路的激活。這也為我們后續(xù)對(duì)槲皮素是否通過(guò)抑制tau蛋白的過(guò)度磷酸化，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)，以期更好地發(fā)揮槲皮素此類植物雌激素在退行性神經(jīng)疾病中的應(yīng)用價(jià)值。