馮 秒， 熊思元， 林亞維*

(1.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070;2.武漢市洪山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430064)

重要生物疾病標(biāo)記物N-聚糖是一種重要的疾病標(biāo)志物，它和癌癥、炎癥、心血管疾病、先天性疾病等多種疾病有關(guān)[1 - 4]，其分析檢測對于疾病的診斷與病理研究具有重要意義。目前聚糖的分析檢測在生物研究、臨床診斷、生物制藥方面得到了廣泛關(guān)注[5 - 6]。然而N-聚糖本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜、離子化效率低、不含生色基團(tuán)[7 - 9]，而復(fù)雜生物樣品中聚糖豐度較低，因此對于復(fù)雜生物基質(zhì)中N-聚糖進(jìn)行高靈敏度、高選擇性分離分析仍是一項艱巨的挑戰(zhàn)。目前N-聚糖主要檢測手段包括毛細(xì)管電泳法、核磁共振法、高效液相色譜法和質(zhì)譜法[10 - 12]?；|(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)以其靈敏度高、步驟簡單、易于操作、分析通量大，以及分析速度快等優(yōu)勢成為檢測聚糖的主要方法之一[13 - 15]。該方法首先利用特異性酶如N-糖酰胺酶F(PNGase F)切斷糖蛋白上的酰胺鍵釋放糖鏈，其次將聚糖與標(biāo)記試劑衍生化標(biāo)記，純化，最后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。常規(guī)的N-聚糖的固相萃取(SPE)純化方法主要依賴于極性，如PGC是通過聚糖的極性實現(xiàn)分離[16]，然而可能導(dǎo)致生物樣品中親水性雜質(zhì)的共洗脫，干擾其質(zhì)譜檢測。

本文采用一種新型SPE純化方法，即氟固相萃取(F-SPE)。采用“一管式”分析方法實現(xiàn)N-聚糖提純與富集。利用含氟試劑2-氨氧基-N-(3-全氟己基)-乙酰胺(PFHA)對N-聚糖還原端進(jìn)行標(biāo)記，增強(qiáng)其疏水性和離子化效率；對標(biāo)記后的N-聚糖與含氟材料之間進(jìn)行F-SPE，去除樣品中蛋白、無機(jī)鹽等雜質(zhì)，實現(xiàn)衍生化N-聚糖的富集與提純，最終達(dá)到MALDI-TOF MS的高靈敏度、高選擇性檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器及試劑

MALDI-TOF/TOF 5800質(zhì)譜儀(美國，SCIEX公司)；HH-1恒溫水浴箱(國華電器有限公司)；WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；5415D高速離心機(jī)(Eppendorf公司(中國))；TW50SPE-12S固相萃取裝置(北京東方)。

麥芽七糖(DP7)、核糖核酸酶B(RNase B)、牛血清白蛋白(BSA)、三氟乙酸均購自美國Sigma公司；2-氨氧基-N-(3-全氟己基)-乙酰胺(PFHA)(美國Fluorous Technologies公司)；冰HAc(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(美國Fisher公司)；2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、肽N-糖酰胺酶F(PNGase F)、甲醇、NH4HCO3(Aladdin(中國)公司)；壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、10X、β-株蛋白生成障礙性貧血洗脫緩沖試劑包(G7緩沖液)均購自美國BioLabs公司；NaCl(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。所用試劑無特殊說明均為分析純。實驗用水為超純水。

人血清樣品由武漢同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院提供。

1.2 實驗步驟

1.2.1 PFHA與DP7的衍生在12.5 μL 10 μmol/L DP7溶液中，依次加入25 μL 2.0 mmol/L PFHA溶液、12.5 μL 0.5%HAc溶液，75 ℃下反應(yīng)2 h得到衍生化DP7溶液，待MALDI-TOF MS分析。

1.2.2 RNase B中N-聚糖的標(biāo)記(1)RNase B的酶解：向10 μL 1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白RNase B溶液中，依次加入50 μL 50 mmol/L NH4HCO3緩沖液溶液，2.4 μL SDS變性緩沖液，混勻后，于100 ℃下反應(yīng)10 min。冷卻至室溫后，加入12 μL 10% NP-40溶液，靜置30 min后加入1.0 μL PNGase F溶液，于37 ℃下酶解18 h，煮沸5 min以終止反應(yīng)。所得溶液經(jīng)混旋、離心干燥后，溶于100 μL超純水中。(2)N-聚糖與PFHA衍生：取0.1 μg酶切產(chǎn)物溶液，依次加入10 μL 4 mmol/L PFHA溶液，5 μL 10% HAc溶液，75 ℃下反應(yīng)2 h得到衍生化溶液。(3)F-SPE萃?。阂来斡?0 μL甲醇預(yù)洗氟化柱3次(內(nèi)填有鑲嵌硅膠的氟化碳材料)，50 μL 30%甲醇/水溶液平衡液潤洗氟化柱5次；將所得的衍生化溶液混旋，離心干燥，溶于100 μL 30%甲醇/水溶液中，進(jìn)行F-SPE，最后用50 μL純甲醇洗脫氟化柱3次，收集洗脫液，真空離心干燥，待MALDI-TOF MS分析。

1.2.3 生物樣品中N-聚糖檢測取5 μg 1 μg/μL血清樣品進(jìn)行酶解處理(處理方式同1.2.2(1))，待樣品冷卻至室溫后蒸干，向酶解得到的混合物中加入50 μL 0.8% 三氟乙酸，于80 ℃下反應(yīng)45 min，以除去糖鏈中唾液酸基團(tuán)。衍生、純化條件同1.2.2。

1.2.4 MALDI-TOF MS分析樣品溶解在20 μL 50%甲醇/水溶液中，混合均勻，并取0.5 μL樣品溶液與0.5 μL基質(zhì)(含有5 mg/mL DHB、5 mmol/L NaAc的50%甲醇混合溶液)，點滴在MALDI金屬板上，在空氣中晾干，待測。質(zhì)譜分析以正離子模式進(jìn)行。MALDI激光光源Nd∶YAG (355 nm，400 Hz)，激光強(qiáng)度為5 500，加速電壓20 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z1 000～5 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 DP7的PFHA標(biāo)記

氟衍生化原理如圖1所示。圖2(A)是12.5 μL 10 μmol/L DP7溶液與25.0 μL 1.0 mmol/L PFHA溶液，12.5 μL 2%HAc溶液，于65 ℃恒溫反應(yīng)2 h得到衍生化DP7質(zhì)譜圖，可以同時觀察到衍生產(chǎn)物DP7-PFHA信號峰[M+Na]+(m/z1607.70)和未經(jīng)衍生的DP7信號峰[M+Na]+(m/z1175.60)，說明反應(yīng)未完全。我們采用歸一化法對衍生效率進(jìn)行計算：衍生產(chǎn)物峰面積(H1)除以剩余DP7峰面積(H2)和產(chǎn)物峰面積總和(H1+H2)。以衍生效率為衡量標(biāo)準(zhǔn)，對反應(yīng)溫度、摩爾比、反應(yīng)時間以及反應(yīng)酸度進(jìn)行了優(yōu)化(圖3)，得到DP7最優(yōu)衍生條件為：反應(yīng)溫度75 ℃，DP7∶PFHA摩爾比為1∶400，反應(yīng)時間2 h，體系中HAc體積分?jǐn)?shù)為0.5%。在最優(yōu)條件下的衍生效率達(dá)到80%，在此條件下對衍生之后的DP7進(jìn)行質(zhì)譜檢測(圖2(B))，未發(fā)現(xiàn)未衍生DP7的峰，而衍生化產(chǎn)物峰[M+Na]+(m/z1607.33)極強(qiáng)，說明該條件下DP7衍生效率高。在此條件下，檢測限低至5 nmol/L的衍生化DP7，此時信噪比為10.71。

圖2 DP7衍生化質(zhì)譜圖(A)和最優(yōu)衍生條件下的DP7衍生化質(zhì)譜圖(B)Fig.2 Mass spectrum of DP7-PFHA derivative(A) and Mass spectrum of DP7-PFHA derivative under optimal derivatization conditions(B)

圖3 衍生條件對DP7衍生效率的影響Fig.3 Effect of derivatization conditions on derivatization efficiency for DP7(a)reaction temperature;(b)molar ratio of PFHA to DP7;(c)reaction time;(d)volume of acetic acid.

2.2 RNase B中N-聚糖的標(biāo)記

2.2.1 RNase B酶解緩沖溶液優(yōu)化實驗分別選取了G7、NH4HCO3作為緩沖溶液進(jìn)行優(yōu)化，圖4(a)、4(b)分別為G7、NH4HCO3作為緩沖溶液，酶切0.1 μg RNase B產(chǎn)物衍生后直接檢測的結(jié)果，圖4(a)中只出現(xiàn)4種N-聚糖信號，均為未衍生聚糖信號，而且有很多雜質(zhì)出現(xiàn)；圖4(b)中，m/z1689.26、1851.29和2013.33信號峰分別對應(yīng)Man5-7衍生產(chǎn)物[M+Na]+?？赡苁荖H4HCO3熱穩(wěn)定相對較差，在離心干燥過程中會逐步分解脫離樣品體系，從而減少其在氟化衍生過程中對體系酸堿度的影響。因此，實驗選用NH4HCO3作為緩沖溶液。

圖4 不同緩沖溶液條件下RNase B中N-聚糖衍生質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of derived N-glycans in RNase B under different buffer solutions (a)NH4HCO3 buffer;(b)G7 buffer.

2.2.2 RNase B中N-聚糖衍生條件優(yōu)化與標(biāo)準(zhǔn)糖DP7相比較，RNase B中N-聚糖衍生需要進(jìn)一步優(yōu)化。我們通過以衍生產(chǎn)物中信號最強(qiáng)的m/z1689.30離子峰峰高作為衡量衍生效率的標(biāo)準(zhǔn)，固定N-聚糖的量為0.1 μg RNase B酶切得到，改變PFHA溶液的濃度和酸度進(jìn)行衍生，得到的衍生產(chǎn)物以50%甲醇溶液為平衡液進(jìn)行F-SPE。從圖5可以看出，最優(yōu)衍生條件為：PFHA(4 mmol/L)用量為10 μL，10% HAc溶液為5 μL。在此條件下成功檢測到4種中性N-聚糖。

圖5 RNase B中N-聚糖衍生質(zhì)譜圖(內(nèi)插圖為PFHA濃度(a)與HAc濃度(b)對衍生效率的影響)Fig.5 Mass spectrum of derived N-glycans in RNase B(Inset:molar ratio of PFHA to DP7(a),volume of acetic acid(b)on derivatization efficiency)

2.3 F-SPE萃取條件的優(yōu)化

圖5中可以看到m/z1689.27、1851.30、2013.32和2175.34這4個信號峰，它們分別對應(yīng)Man5-8四種產(chǎn)物[M+Na]+離子峰，缺少M(fèi)an-9衍生產(chǎn)物離子峰，且在該條件下質(zhì)譜圖中出現(xiàn)較多雜峰，這可能是由于所用洗脫條件并不適用于該分析方法，雜質(zhì)殘留，影響聚糖的檢測，因此需要對F-SPE洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。據(jù)此采用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液為平衡液進(jìn)行F-SPE。仍以質(zhì)譜圖中信號響應(yīng)最強(qiáng)的m/z1 689.30離子峰峰高作為衡量F-SPE效率的標(biāo)準(zhǔn)，可以發(fā)現(xiàn)以30%甲醇為平衡液F-SPE富集效率最高。在此條件下進(jìn)行質(zhì)譜檢測，可以觀察到RNase中Man5-9的5個信號峰(m/z=1689.30、1851.29、2013.37、2175.33和2337.38)。在此條件下，可成功檢測到5 ng/μL的RNase B中5種N-聚糖，且信噪比為3.74。

2.4 F-SPE的選擇性

在RNase B(0.1 μg)酶解得到的N-聚糖中，加入1 μg BSA以及10 μg NaCl，經(jīng)過PFHA衍生和F-SPE后，檢測結(jié)果如圖6所示。在非糖基化蛋白和鹽濃度較大的情況下，依然可清楚地觀測到RNase B中所有N-聚糖Man5-9的5個[M+Na]+離子峰。表明此方法具有良好的選擇性和抗干擾性能。

2.5 人血清樣品檢測

將PFHA衍生結(jié)合F-SPE的MALDI-TOF MS方法應(yīng)用到5 μg 1 μg/μL人血清樣品中N-聚糖的檢測。按照上述所得的最優(yōu)條件下進(jìn)行衍生、純化、檢測(圖7)，成功檢測到12種N-聚糖。表明該方法在生物樣品檢測中具有良好的適用性。

圖6 加入1 μg BSA及10 μg NaCl后衍生RNase B的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum of derived RNase B after spiked with 1 μg BSA and 10 μg NaCl

圖7 人血清中N-聚糖的質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum of N-glycans in human serum

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種PFHA衍生，結(jié)合F-SPE后MALDI-TOF MS檢測N-聚糖的方法。該方法在增強(qiáng)N-聚糖疏水性，提高其離子化效率的同時實現(xiàn)其高效富集純化，有效提高生物樣品中N-聚糖豐度，降低雜質(zhì)對其質(zhì)譜信號的干擾，達(dá)到高選擇性、高靈敏度檢測N-聚糖的目的。通過此方法，我們最終可以檢測到5 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白RNase B的所有N-聚糖，并將此方法運(yùn)用到5 μg血清樣品的檢測，成功檢測到12種N-聚糖。該方法具有操作簡便、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點，為復(fù)雜生物樣品中N-聚糖的分析提供了新的有利方法。