郎海燕 張 玲 王 佳 張雅月 王 沖 范秋月 張佳諾 陳信義

原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一類由細(xì)胞和體液免疫異常導(dǎo)致血小板破壞增多的自身免疫病[1]。ITP臨床表現(xiàn)以廣泛的皮膚、黏膜出血為主，急性發(fā)病者可出現(xiàn)危及生命的內(nèi)臟出血或腦出血，且出血風(fēng)險(xiǎn)隨年齡的增加而增加，但與患者外周血小板數(shù)量減少程度并不一致，尤其慢性患者甚至血小板計(jì)數(shù)不在安全水平，也不會(huì)發(fā)生廣泛或嚴(yán)重出血。因此，對(duì)于ITP的治療除有效地防治出血癥狀，穩(wěn)定外周血小板數(shù)值在安全水平外，控制或改善患者臨床癥狀，特別是乏力癥狀至關(guān)重要。通過臨床實(shí)踐證明，以中醫(yī)藥為主或輔助治療在防治ITP患者出血、穩(wěn)定外周血小板數(shù)值以及改善臨床癥狀等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。因此，筆者在協(xié)作進(jìn)行國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973”計(jì)劃)項(xiàng)目臨床試驗(yàn)過程中，分別檢測(cè)了患者經(jīng)健脾益氣攝血顆粒治療前后血小板相關(guān)抗體、T淋巴細(xì)胞及其亞群變化，以期證實(shí)健脾益氣攝血顆粒具有免疫調(diào)控效果。

對(duì)象與方法

1.病例標(biāo)準(zhǔn):(1)免疫性血小板減少癥診斷標(biāo)準(zhǔn):參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》制定的ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：①多次實(shí)驗(yàn)室檢查血小板計(jì)數(shù)減少；②脾臟不增大或僅輕度增大；③骨髓檢查巨核細(xì)胞增多或正常，有成熟障礙；④以下5點(diǎn)中應(yīng)具備任何1點(diǎn)：A.潑尼松治療有效；B.切脾治療有效；C.PAIgG(血小板抗體IgG)增多；D.PAC3(血小板抗體補(bǔ)體C3)增多；E.血小板壽命縮短；⑤并可排除繼發(fā)性血小板減少癥。(2)脾不統(tǒng)血證診斷標(biāo)準(zhǔn):參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中“中藥新藥治療脾虛證臨床研究指導(dǎo)原則”與“中藥新藥治療氣虛證臨床研究指導(dǎo)原則”[3]，結(jié)合疾病臨床特征擬定“脾不統(tǒng)血證”標(biāo)準(zhǔn)[4]：①主癥：慢性出血(反復(fù)皮下瘀點(diǎn)或瘀斑，色澤淡；月經(jīng)過多或經(jīng)期延長(zhǎng)等)，伴隨體倦乏力、神疲懶言；②次癥：食欲不振、食后腹脹；③舌脈：舌體胖大，邊有齒印，舌淡；脈象細(xì)弱。具備主癥2項(xiàng)(第1項(xiàng)必備)，次癥1項(xiàng)，結(jié)合舌脈可診斷。(3)出血程度與血小板減少分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):參照2010年衛(wèi)生部醫(yī)政司發(fā)布的《免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑》，將出血程度與血小板計(jì)數(shù)減少分4級(jí)并記分，見表1[5]。(4)納入病例標(biāo)準(zhǔn):同時(shí)具備下列3項(xiàng)：①符合免疫性血小板減少癥疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合中醫(yī)“脾不統(tǒng)血”中醫(yī)證候辨證標(biāo)準(zhǔn)；③自愿受試，并簽署知情同意書。(5)排除病例標(biāo)準(zhǔn):具備下列任意1項(xiàng)：①合并嚴(yán)重心臟、腦、肝臟、腎臟疾?。虎诰癫』颊?；③妊娠、哺乳期婦女；④有嚴(yán)重糖尿病、高血壓并發(fā)癥患者；⑤已知對(duì)受試藥物或處方中某個(gè)單味中藥過敏者。(6)中止和剔除病例標(biāo)準(zhǔn)：符合下列任意1項(xiàng)：①不能堅(jiān)持治療；②臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)或嚴(yán)重并發(fā)癥；③病情加重，需另行治療。

表1 血小板計(jì)數(shù)減少與出血程度分級(jí)記分標(biāo)準(zhǔn)

2.研究方法：(1)臨床分組與治療方法:用中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院臨床評(píng)價(jià)中心設(shè)計(jì)的中央隨機(jī)系統(tǒng)，按隨機(jī)抽取的藥物編號(hào)將受試者分配到健脾益氣攝血顆粒組(試驗(yàn)組)、健脾益氣攝血顆粒聯(lián)合潑尼松組(聯(lián)合組)、潑尼松組(西藥組)。健脾益氣攝血配方顆粒(黃芪20g、黨參15g、茯苓15g、白術(shù)10g、阿膠15g、茜草10g、炙甘草6g；北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，每次1袋，每日2次；潑尼松首次劑量按1.0～1.5mg/(kg·d)，早8：00時(shí)頓服，治療期間有效減量。健脾益氣攝血聯(lián)合強(qiáng)的松組聯(lián)合使用健脾益氣攝血配方顆粒和潑尼松(用量用法同上)。21天為1個(gè)療程。(2) 觀察指標(biāo)檢測(cè)方法：于第1、7、14、21天進(jìn)行訪視，觀察患者出血程度變化，并采集患者外周血，應(yīng)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀器檢測(cè)外周血象中血小板計(jì)數(shù)，進(jìn)行血小板減少程度評(píng)分值；于第1、4次訪視點(diǎn)，采集患者外周血，送北京海思特臨床檢驗(yàn)所，按T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒說明，流式細(xì)胞儀法檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其相關(guān)亞群；以酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制法(ELISA)檢測(cè)血小板相關(guān)抗體(PAIgG、PAIgA、PAIgM)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：同一組治療前后比較若差值符合正態(tài)分布，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；若前后差值非正態(tài)分布，采用符號(hào)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。組間比較時(shí)，若同時(shí)符合正態(tài)分布且方差齊，則采用ANOVA單因素方差分析；若各組均正態(tài)分布但方差不齊，采用Welch檢驗(yàn)；若非正態(tài)分布，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。頻數(shù)及構(gòu)成比的檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)/Fisher確切概率法(當(dāng)理論頻數(shù)<5的單元數(shù)超過20%時(shí))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.一般資料:采用中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院臨床所設(shè)計(jì)的中央隨機(jī)系統(tǒng)，按照臨床試驗(yàn)方案規(guī)定入選病例標(biāo)準(zhǔn)，自2012年8月～2016年8月，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院等18家三級(jí)甲等中醫(yī)醫(yī)療單位競(jìng)爭(zhēng)入組ITP患者273例，經(jīng)反復(fù)核對(duì)臨床試驗(yàn)資料，有1例因不符合入選標(biāo)準(zhǔn)而剔除，進(jìn)入全分析集受試者共272例(試驗(yàn)組104例，聯(lián)合組103例，西藥組65例)。入組時(shí)人口學(xué)資料見表2。

表2 3組病例入組時(shí)人口學(xué)資料

2.出血程度與血小板計(jì)數(shù)減少評(píng)分值變化：3組病例出血與血小板計(jì)數(shù)減少評(píng)分值觀察結(jié)果見表3。

表3 3組病例出血程及血小板計(jì)數(shù)減少評(píng)分值比較分)

與治療前比較，*P<0.05；與試驗(yàn)組相同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與西藥組相同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05

從治療第7天開始，試驗(yàn)組、聯(lián)合組的出血程度評(píng)分值較入組時(shí)明顯下降，與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而西藥組從14天開始積分下降。說明西藥組止血效果晚于試驗(yàn)組、聯(lián)合組。3組病例治療后各訪視點(diǎn)血小板計(jì)數(shù)減少程度評(píng)分值較治療前有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。末次訪視點(diǎn)，聯(lián)合組血小板評(píng)分值下降幅度最優(yōu)，與試驗(yàn)組相同時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定值變化:3組病例T淋巴細(xì)胞亞群檢入結(jié)果見表4。試驗(yàn)組CD4+CD25+治療后測(cè)定值與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4.T淋巴細(xì)胞亞群正常和異常比例:3組病例T淋巴細(xì)胞亞群正常和異常百分比統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。

表4 3組病例T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定值比較

與治療前比較，*P<0.05；與試驗(yàn)組治療后比較，△P<0.05

第4次訪視點(diǎn)聯(lián)合組檢測(cè)的CD3+CD4+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞正常和異常例數(shù)，與試驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

5.血小板相關(guān)抗體變化：3組病例血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM檢測(cè)結(jié)果見表6。各組治療前后血小板抗體測(cè)定值組內(nèi)或組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

ITP的確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清晰，目前普遍認(rèn)為該病為異質(zhì)性免疫性疾病，體液與細(xì)胞免疫功能失調(diào)承擔(dān)著始動(dòng)角色。在體液免疫方面，抗體介導(dǎo)的血小板破壞被認(rèn)為是ITP的經(jīng)典發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)已證實(shí)50%～60%的ITP患者血小板表面可檢測(cè)到抗血小板糖蛋白的血小板自身抗體，包括血小板相關(guān)抗體(PAIg)和血小板特異性抗體(PSIg)。這些抗體主要是IgG型，也有IgM、IgA等?？贵w與血小板膜抗原結(jié)合后形成抗原抗體復(fù)合物，由單核-吞噬細(xì)胞攝取后在脾臟中被破壞。吳意紅等[6]研究發(fā)現(xiàn)，歸脾丸不僅能夠提高患者外周血小板計(jì)數(shù)，亦能降低血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM，總體療效與激素相當(dāng)。B細(xì)胞通常作為抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生抗體，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，也可以通過分泌調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或通過細(xì)胞與細(xì)胞接觸，直接與病原的T細(xì)胞相互作用，從而在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。這類B細(xì)胞被稱作調(diào)節(jié)性B細(xì)胞[7，8]。細(xì)胞免疫異常在ITP發(fā)生、發(fā)展過程中也有重要作用，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的特殊T細(xì)胞亞群。有研究表明，ITP患者存在Treg細(xì)胞數(shù)量及功能的異常[9,10]，與正常對(duì)照比較，ITP 患者尤其是活動(dòng)性和(或)血小板計(jì)數(shù)特別低的患者，外周Treg數(shù)量明顯減少。目前研究較多的是檢測(cè)CD4+CD25+Treg細(xì)胞，其是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種特殊的專職免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要通過抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖、分化及其免疫功能和抑制自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞等細(xì)胞的功能來維持自身免疫平衡。有研究者通過不同實(shí)驗(yàn)方法均得出一致結(jié)論，初診和復(fù)發(fā)的ITP患者體內(nèi)CD4+和CD25+Treg細(xì)胞明顯低于正常對(duì)照組和緩解期ITP患者，表明ITP患者體內(nèi)可能由于缺乏Treg細(xì)胞，從而使自身免疫反應(yīng)不能被有效抑制，導(dǎo)致自身免疫平衡失調(diào)[11]。Arandi等[12]報(bào)道，ITP患者CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，功能降低。吳曉勇等[13]建立ITP小鼠動(dòng)物模型，檢測(cè)脾Treg細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞比例減少、TGF-β1水平降低與ITP的細(xì)胞免疫失調(diào)相關(guān)。上述研究充分證明，T、B細(xì)胞免疫功能紊亂在ITP發(fā)病機(jī)制中占有重要位置。

表5 3組病例T淋巴細(xì)胞亞群正常與異常病例數(shù)比較 [n(%)]

與試驗(yàn)組比較，*P<0.01；治療前后正常/異常應(yīng)等于本組入組病例數(shù)，本表治療前后病例數(shù)少于入組病例數(shù)均為該項(xiàng)目檢測(cè)的缺失病例數(shù)

表6 3組病例治療前后血小板抗體測(cè)定值比較(ng/ml)

本研究從治療第7天開始，試驗(yàn)組、聯(lián)合組的出血程度評(píng)分值較入組時(shí)明顯下降，與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而西藥組從14天開始。說明西藥組止血效果晚于試驗(yàn)組、聯(lián)合組；3組病例治療后各訪視點(diǎn)血小板計(jì)數(shù)減少程度評(píng)分值較治療前有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。末次訪視點(diǎn)，聯(lián)合組血小板評(píng)分值下降幅度最優(yōu)，與試驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該項(xiàng)研究從臨床角度證明，益氣健脾攝血顆粒對(duì)ITP有明確的治療效果。試驗(yàn)組CD4+CD25+細(xì)胞療后測(cè)定值與療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明健脾益氣攝血顆粒能夠升高CD4+CD25+細(xì)胞，調(diào)節(jié)ITP患者紊亂的免疫機(jī)制，維系自身免疫穩(wěn)態(tài)。與試驗(yàn)組比較，第4次訪視點(diǎn)聯(lián)合組檢測(cè)的CD3+CD4+、CD19+正常和異常差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD3+代表人體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，CD4+是調(diào)控免疫反應(yīng)最重要樞紐細(xì)胞，CD19+則與B細(xì)胞免疫相關(guān)。 從上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合組不但能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫，也可調(diào)控B細(xì)胞免疫。各組治療前后血小板抗體測(cè)定值組內(nèi)或組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其研究結(jié)果與何牧卿等[14]、Sakakura等[15]臨床研究結(jié)論相一致。該研究結(jié)果可以說明，調(diào)節(jié)免疫尤其是調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫可能是健脾益氣攝血顆粒治療ITP機(jī)制之一。但由于治療時(shí)間僅21天，尚不能按照ITP療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)判定療效。同時(shí)，本研究中T細(xì)胞及其亞群以及血小板相關(guān)抗體觀察結(jié)果尚不能提供健脾益氣攝血顆粒具有明確調(diào)節(jié)免疫功能相關(guān)證據(jù)，有待于進(jìn)一步開展臨床或基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行彌補(bǔ)或輔助說明。