張愛華

年齡相關(guān)性白內(nèi)障是一種老年多發(fā)性眼病，由晶狀體功能紊亂引起，嚴重者可致盲，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。隨著年齡增加，氧化應(yīng)激、紫外線損傷、鈣蛋白酶激活、細胞凋亡等因素已被證明與內(nèi)障發(fā)病具有密切聯(lián)系[1,2]。然而到目前為止，對于白內(nèi)障發(fā)病機制的認識不統(tǒng)一，仍需進一步探索。

αB-晶狀體蛋白(αB-crystallin，編碼基因CRYAB)是晶狀體組織中最關(guān)鍵的蛋白之一，其基本功能是識別并結(jié)合有聚集傾向的非天然蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)折疊過程中的中間產(chǎn)物，穩(wěn)定靶蛋白分子的構(gòu)象，防止形成不可逆的蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)物[3～5]。因此，αB-crystallin對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量的穩(wěn)定以及細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有著十分重要的作用，近年來發(fā)現(xiàn)αB-晶狀體蛋白參與多種細胞生理和應(yīng)激過程，表現(xiàn)出某種抗組織細胞損傷的保護功能，在白內(nèi)障中發(fā)揮關(guān)鍵保護作用[6, 7]。

microRNA(miRNA)已被發(fā)現(xiàn)在白內(nèi)障晶狀體上皮細胞氧化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。例如miR-138通過下調(diào)人晶狀體上皮細胞抗氧化應(yīng)激的能力，抑制人晶狀體上皮細胞增殖和修復(fù)參與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)展[8]。另外，αB-crystallin已被證明可作為miRNA的靶基因，對腫瘤細胞發(fā)揮調(diào)控作用[9]。miR-513b-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的促凋亡調(diào)控分子，在睪丸癌細胞中發(fā)揮多種關(guān)鍵功能[10]。通過嚴格的生物信息學分析，筆者推測αB-crystallin可能在晶狀體組織中作為miR-513b-5p的靶基因發(fā)揮作用。本研究擬在年齡相關(guān)性白內(nèi)障組織和晶狀體上皮細胞中探究miR-513b-5p是否通過調(diào)控αB-crystallin對細胞凋亡和氧化應(yīng)激發(fā)揮作用。

材料與方法

1.臨床資料與樣本：收集2016年6月～2018年3月，復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院眼科住院行混濁晶體摘除的白內(nèi)障患者15例(白內(nèi)障組)。白內(nèi)障組納入標準及入組例數(shù)：除白內(nèi)障外無其他眼科病變，無腫瘤發(fā)生；實際納入男性9例，女性6例，平均年齡64.80歲。對照組(control組)納入標準及入組例數(shù)：復(fù)旦大學中山醫(yī)院因受傷行眼球摘除的健康者透明晶狀體組織10份(男、女性來源各5份，平均年齡61.25歲)。白內(nèi)障組與對照組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，說明兩組間具有可比性。兩組晶狀體組織特征：對照組所有晶狀體均呈清亮狀，無混濁，白內(nèi)障組所有晶狀體組織呈現(xiàn)明顯灰白色渾濁。研究資料中所涉及的所有志愿者均已簽訂知情同意書。

2.細胞培養(yǎng)：人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。細胞使用DMEM培養(yǎng)液和10%的FBS常規(guī)培養(yǎng)于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中。

3.細胞處理和細胞轉(zhuǎn)染：待細胞融合率達到80%后，將細胞濃度調(diào)整為1×106，對SRA01/04細胞轉(zhuǎn)染miR-513b-5p的擬似物mimic或者陰性controlmimic-NC 24h(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。單獨使用H2O2誘導1h，或者SRA01/04細胞轉(zhuǎn)染miR-513b-5p抑制劑inhibitor或陰性controlinhibitor-NC 24h的基礎(chǔ)上繼續(xù)使用400μmol/L H2O2誘導1h。聯(lián)合使用擬似物mimic和αB-crystallin穩(wěn)定過表達質(zhì)粒cDNA3.1-αB-crystallin(c-CRYAB)共轉(zhuǎn)染細胞(mimic+c-CRYAB)，或者與陰性controlcDNA3.1-null(c-null)共轉(zhuǎn)染細胞(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

4.實時定量PCR(RT-qPCR)：對各組細胞或者組織進行裂解，TRIzol法抽提細胞總RNA，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，miRNA反轉(zhuǎn)錄使用miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成。cDNA特定RNA產(chǎn)物的產(chǎn)量檢測使用SYBR?Green Master Mix，U6(miRNA)為內(nèi)參對miR-513b-5p的表達量進行標準化處理。反應(yīng)體系(20μl)：10μl SYBR，2.0ng模板cDNA，正反向引物濃度均為20μmol/L，體積為0.8μl，最終使用滅菌蒸餾水加至20μl。PCR過程：40個循環(huán)， 94℃，1min；54℃，1min；聚合72℃，1min；延伸 72℃，7min。引物序列見表1。miR-513b-5p的相對表達使用公式2-ΔΔCt計算。

表1 引物序列表

5.Western blot法檢測：細胞加入蛋白裂解液以裂解細胞，BAC法檢測蛋白濃度。配制SDS-PAGE凝膠后行蛋白電泳后將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉3h，分別使用相應(yīng)的一抗rabbit anti-αB-crystallin(ab13497，1∶800)、anti-ROS (ab5512，1∶900)、anti-SOD (ab83108，1∶900)、anti-c-caspase3(ab214430，1∶600)anti-GAPDH(ab9485，1∶8000)進行孵育，孵育過夜后PBS洗滌3次，每次10min，隨后使用辣根過氧化物酶HRP anti-rabbit IgG(1∶10000)室溫孵育1h。使用ECL化學發(fā)光液進行顯色。灰度值使用Image J V1.49軟件進行分析。

6.細胞凋亡率檢測：使用細胞凋亡 ELISA試劑盒(德國Roche Diagnostics公司)。各組細胞轉(zhuǎn)入96-孔板。使用200μl裂解緩沖液對細胞進行裂解30min。細胞質(zhì)溶解物轉(zhuǎn)入雙抗涂抹的細胞板中，加入Anti-DNA-POD和Anti-histone-biotin 孵育2h。使用酶標儀檢測405nm和490nm 波長的吸光度值。

7.熒光素酶報告基因?qū)嶒灒菏褂胢iRNA-target gene預(yù)測網(wǎng)站TargetScan(http://www.targetscan.org)和miRDB(http://mirdb.org)預(yù)測miR-513b-5p與CRYAB的結(jié)合關(guān)系。進一步，筆者構(gòu)建熒光素酶報告質(zhì)粒對該預(yù)測的結(jié)合關(guān)系進行熒光素酶報告分析。對CRYAB的3′-UTR 區(qū)的mRNA亞克隆進入pmirGLO載體(美國Promega公司)從而構(gòu)建形成pmirGLO-Luc-CRYAB-3′UTR 野生型報告基因。使用lipofectamine 2000(美國Life Technologies公司)將報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SRA01/04細胞轉(zhuǎn)染48h。Dual-Glo熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)檢測熒光素酶活性，使用海腎熒光素酶的活性進行標準化處理。

結(jié) 果

1. 白內(nèi)障患者晶狀體組織中miR-513b-5p 和αB-crystallin的表達變化：檢測晶狀體組織中miR-513b-5p和αB-crystallin的表達變化。首先利用RT-qPCR方法檢測對照組和白內(nèi)障組中miR-513b-5p 和αB-crystallin的表達變化。與對照組比較，白內(nèi)障組中miR-513b-5p的水平上調(diào)，而αB-crystallin的mRNA水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1A、B)；其次利用Western blot法檢測αB-crystallin的蛋白水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，αB-crystallin的蛋白水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1C、D)。

圖1 白內(nèi)障患者晶狀體組織中miR-513b-5p和αB-crystallin的表達A.miR-513b-5p；B.αB-crystallin的mRNA水平相對表達變化；C.αB-crystallin與GAPDH的Western blot法條帶；D.αB-crystallin的蛋白相對表達柱形圖；n=3

2.人晶狀體上皮細胞中過表達miR-513b-5p抑制αB-crystallin的表達：對人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-513b-5p的擬似物mimic，即mimic組，該組分別與未添加mimic的陰性對照組(mimic-NC組)和對照組比較發(fā)現(xiàn)，mimic組的miR-513b-5p水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2A)，mimic-NC與對照組比較，miR-513b-5p的水平變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2A)，成功地過表達了miR-513b-5p。另外對αB-crystallin蛋白水平變化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別與mimic-NC組和對照組比較，mimic組的αB-crystallin的蛋白下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2B)，mimic-NC與對照組比較，αB-crystallin的蛋白水平變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2B)。對SRA01/04細胞轉(zhuǎn)染miR-513b-5p的抑制劑inhibitor(inhibitor組)，24h后發(fā)現(xiàn)inhibitor可以顯著抑制miR-513b-5p的水平(P<0.05，圖2C)。另一組未添加該抑制劑(inhibitor-NC組)。Western blot法檢測αB-crystallin蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，inhibitor組的αB-crystallin表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2D)；inhibitor-NC組的αB-crystallin表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2D)。

圖2 人晶狀體上皮細胞中調(diào)節(jié)miR-513b-5p水平對αB-crystallin表達影響A.miR-513b-5p的相對表達變化；B.αB-crystallin的蛋白水平相對表達變化；C.miR-513b-5p的相對表達變化；D.αB-crystallin的蛋白水平相對表達變化； 與對照組比較，*P<0.05，n=3

3.miR-513b-5p促進人晶狀體上皮細胞氧化應(yīng)激：使用inhibitor轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞24h，并繼續(xù)對細胞進行400μmol/L H2O2誘導1h(inhibitor+H2O2組)，而inhibitor-NC組也添加400μmol/L H2O2(inhibitor-NC+H2O2組)以作對比。通過Western blot法檢測活性氧(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)的表達水平變化來評估SRA01/04細胞的的氧化應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨H2O2組比較，inhibitor+H2O2組中ROS的表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A),而inhibitor-NC+H2O2組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3A)。Western blot法檢測SOD表達水平的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨H2O2組比較，inhibitor+H2O2組中SOD的表達水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B)，而inhibitor-NC+H2O2組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖3B)。另外，與對照組比較，mimic組中ROS表達水平上調(diào)，且SOD表達水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3C)，而與單獨H2O2組比較，mimic組的ROS表達水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3C)。

4.miR-513b-5p促進人晶狀體上皮細胞的凋亡：通過測定細胞凋亡率和c-caspase3蛋白表達水平考察miR-513b-5p過表達對SRA01/04細胞凋亡的作用。與對照組比較，mimic組的細胞凋亡率和c-caspase3蛋白水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3D、E)，而mimic-NC組與對照組比較，細胞凋亡率和c-caspase3蛋白水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3D、E)。miR-513b-5p可促進人晶狀體上皮細胞的凋亡。

5.αB-crystallin是miR-513b-5p的靶基因：通過Targetscan及Targets and Expression生物信息學軟件預(yù)測，αB-crystallin很有可能是miR-513b-5p的靶基因(圖4A)。為了進一步證實這一預(yù)測，采用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-513b-5p與αB-crystallin的關(guān)系。構(gòu)建野生型(WT)及突變型(mut)的αB-crystallin(CRYAB) 3′-UTR并克隆到熒光素酶報告基因下游，與對照組比較，miR-513b-5p下調(diào)WT- CRYAB的3′-UTR水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4B)。然而與對照組比較，miR-513b-5p對mut-CRYAB的3′-UTR水平無改變，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4B)，在人晶狀體上皮細胞中CRYAB是miR-513b-5p的下游靶基因。

圖3 miR-513b-5p對晶狀體上皮細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響A.ROS相對表達變化；B.SOD相對表達變化，n=3;C.ROS相對表達變化；D.細胞凋亡率的相對變化；E.c-caspase3相對表達變化；n=3

圖4 αB-crystallin是miR-513b-5p的功能性靶基因A.CRYAB(αB-crystallin)的3′UTR和miR-513b-5p結(jié)合位點；B.熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CαB-crystallin是miR-513b-5p的下游靶基因； n=3(WT.wild type；mut.mutant type)；C.細胞凋亡率的相對變化；D.ROS相對表達變化；c-CRYAB.CRYAB的過表達質(zhì)粒，c-null.CRYAB過表達的陰性對照

對SRA01/04細胞轉(zhuǎn)染mimic基礎(chǔ)上繼續(xù)使用轉(zhuǎn)染αB-crystallin過表達質(zhì)粒c-CRYAB(mimic+c-CRYAB組)，檢測細胞氧化應(yīng)激和凋亡率的變化，驗證αB-crystallin是否為miR-513b-5p的功能性靶基因。與僅添加未修飾質(zhì)粒的mimic組(mimic+c-null組)比較，mimic+c-CRYAB組的細胞凋亡率下降，而且ROS的表達水平也下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4C)，但是mimic+c-null組與mimic組比較，細胞凋亡率變化和ROS的表達水平變化比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4D)。

討 論

αB-crystallin是一種維持的晶狀體細胞內(nèi)在穩(wěn)定的關(guān)鍵蛋白[11]，因此在白內(nèi)障等晶狀體疾病中αB-crystallin具有明顯的差異性表達[12]。本研究中，白內(nèi)障患者晶狀體上皮組織中αB-crystallin的表達明顯下調(diào)，而miR-513b-5p的表達水平卻明顯上升。在體外研究中，筆者研究發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細胞的氧化應(yīng)激能力和凋亡率均被高表達miR-513b-5p所上調(diào)。通過生信分析方法的預(yù)測以及熒光素酶基因報告實驗，確認晶狀體上皮細胞中αB-crystallin是miR-513b-5p的靶基因，其表達受miR-513b-5p的直接調(diào)控。進一步發(fā)現(xiàn)miR-513b-5p可通過對αB-crystallin蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)從而參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細胞的氧化應(yīng)激和凋亡。

miR-513家族成員能調(diào)節(jié)多種細胞的凋亡[13, 14]。研究發(fā)現(xiàn)miR-513b-5p能夠誘導睪丸胚胎癌細胞，而miR-513b可誘導胃癌細胞凋亡，另外miR-513可以調(diào)控干擾素γ誘導的人類呼吸道細胞凋亡[10,15,16]。本研究中miR-513b-5p可促進晶狀體上皮細胞中c-caspase3的表達和細胞凋亡率。另外，miR-513b-5p過表達可明顯促進晶狀體上皮細胞的氧化應(yīng)激標記分子ROS的水平并抑制抗氧化標志物SOD的表達，而且miR-513b-5p抑制劑能夠明顯抑制因H2O2誘導的氧化應(yīng)激標志物的增加。以上研究表明，miR-513b-5p不僅促進人晶狀體上皮細胞的凋亡，而且可能對晶狀體上皮細胞的氧化應(yīng)激具有促進作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-513b-5p可直接靶向調(diào)控白內(nèi)障發(fā)展關(guān)鍵調(diào)控因子αB-crystallin，通過生物信息學分析和熒光素酶報告基因?qū)嶒灻鞔_了在晶狀體上皮細胞中miR-513b-5p通過miRNA-target機制對αB-crystallin進行直接抑制。以往研究表明，αB-crystallin同樣可作為miR-491的靶基因參與調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的肺轉(zhuǎn)移[9]。而且近年來發(fā)現(xiàn)αB-crystallin參與多種細胞的凋亡和應(yīng)激過程，在白內(nèi)障中發(fā)揮關(guān)鍵保護作用[6, 17～20]。因此提示miR-513b-5p對于晶狀體上皮細胞的凋亡和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)很可能是通過調(diào)控αB-crystallin而發(fā)揮作用。為了明確這一推測，在晶狀體上皮細胞中聯(lián)合過表達miR-513b-5p和αB-crystallin，與單獨過表達miR-513b-5p比較，在誘導的miR-513b-5p調(diào)控凋亡和氧化應(yīng)激分子標志物均被過表達αB-crystallin所抑制。研究表明，miR-513b-5p可通過抑制αB-crystallin促進晶狀體上皮細胞的凋亡和氧化應(yīng)激。

綜上所述，αB-crystallin是miR-513b-5p的靶基因，其表達受miR-513b-5p的直接調(diào)控。而且miR-513b-5p可通過對αB-crystallin蛋白的調(diào)節(jié)從而參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細胞的氧化應(yīng)激和凋亡，為白內(nèi)障機制研究提供了新的思路，為白內(nèi)障的治療提供新的潛在靶點。