谷成燕，賀艷麗，白若琬，韓保萍

（山東博士倫福瑞達制藥有限公司，山東 濟南 250101）

氯化鈉滴眼液的主要成分為氯化鈉，其次還含有玻璃酸鈉等成分，主要用于緩解眼睛疲勞引起的局部干澀。該滴眼劑為多劑量劑型，制劑中加入了抑菌劑苯扎氯銨。為控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證滴眼液的用藥安全，需要對苯扎氯銨的含量進行控制。本文依據(jù)美國藥典苯扎氯銨[1]含量測定的色譜條件，對進樣體積及流速進行了優(yōu)化，根據(jù)藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則[2]及美國藥典34＜621＞[1]的要求，對該方法進行了系統(tǒng)適用性、專屬性、準確度、精密度、線性和范圍及耐用性的驗證，結果表明，該法能有效測定本品苯扎氯銨含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測器（美國沃特世公司）；Agilent Technologies 1260 infinity液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BP211D電子天平（賽多利斯）；XP205電子分析天平（梅特勒-托利多）；FE-20 S20K型酸度計（梅特勒-托利多）；DHG-9030A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器）；YB-3型澄明度檢測儀（天津大學精密儀器廠）。

1.2 試藥

氯化鈉滴眼液（山東博士倫福瑞達）；苯扎氯銨對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號201102，按C22H40ClN計，每1 ml中含苯扎氯銨為11.10 mg）；注射用玻璃酸酶（1500單位/瓶，上海上藥第一生化藥業(yè)）；無水醋酸鈉，冰醋酸（分析純，天津科密歐）；乙腈（色譜純，Dikma Tech）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 空白溶液 按處方組份及比例（除氯化鈉外）配制。

2.1.2 對照品溶液 精密量取苯扎氯銨對照品適量，用水定量稀釋制成每1 ml中含30 μg溶液。

2.1.3 供試品溶液 供試品用注射用玻璃酸酶酶解[3-4]（酶解溫度為37±0.5 ℃，酶濃度為60單位/ml，酶解時間為20 min）后直接進樣。

2.2 色譜條件及優(yōu)化

2.2.1 美國藥典苯扎氯銨測定色譜條件 用氰基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以醋酸鈉溶液（無水醋酸鈉8.2 g，加水1000 ml使溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0）-乙腈（55：45）為流動相；流速為2 ml/min；檢測波長為262 nm。

該色譜條件下苯扎氯銨的測定濃度為4 mg/ml，進樣體積為20 μl，則進樣量為80 μg，本品中苯扎氯銨濃度為30 μg/ml，選用最大進樣體積100 μl，則進樣量為3 μg。試驗結果表明，該色譜條件下，苯扎氯銨拖尾因子為1.0～1.3，相鄰峰之間分離度為2.0～2.1，系統(tǒng)適用性符合要求。

2.2.2 參數(shù)選擇及優(yōu)化

2.2.2.1 檢測波長的選擇 從供試品全波長掃描光譜圖可知，苯扎氯銨在209 nm與262 nm的波長處有最大吸收。因流動相中含有的醋酸鹽在酸性條件下形成醋酸（吸收波長為210 nm），其濃度遠高于分析物，導致其210 nm處強烈的底吸收完全掩蓋了苯扎氯銨的紫外吸收，為避免209 nm處流動相的干擾，選擇262 nm作為苯扎氯銨含量測定的檢測波長，與中國藥典妥布霉素滴眼液等[5]品種下苯扎氯銨含量測定的檢測波長一致。

2.2.2.2 流速的選擇 由于本品中苯扎氯銨含量較低，為提高測定的準確度，需選擇較高的靈敏度，提高峰面積的響應因子，而當進樣量一定時，PDA檢測器的積分響應值（峰面積）與流動相流速成反比[6]，因此需選擇較低的柱流速進行含量測定。依據(jù)中國藥典常見流速，設定流速為1 ml/min，并將測定結果與流速為2 ml/min進行比較。在不同的流速下測定同一供試品中苯扎氯銨的含量，其一致性為99.6 %。苯扎氯銨峰的響應因子隨著流速的增大而減小，流速為1 ml/min的響應因子約為2 ml/min的2倍。為增大其響應因子，提高測定的靈敏度與準確度，選擇流速為1 ml/min。

2.2.2.3 進樣體積的選擇 為使方法具有良好的分離度與檢測靈敏度，需選擇合適的進樣量。進樣量過大，可能導致色譜柱超載，致使樣品峰展寬，峰形改變；進樣量過小，又可能導致方法靈敏度過低。本品中含苯扎氯銨濃度僅為0.003 %，因此采用直接進樣對其進行測定，為避免進樣量對分離及測定結果的影響，需選擇合適的進樣體積。通過不同進樣體積的供試品溶液的重復性結果與苯扎氯銨拖尾因子大小，為保證良好的重復性，同時減小柱負載，選擇進樣體積為80 μl。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 酸（堿、氧化）破壞 取本品及苯扎氯銨空白各8 ml，分別置入安瓿，加1 mol/L鹽酸溶液（1mol/L氫氧化鈉溶液、3 %過氧化氫溶液）各1 ml，搖勻，密封，室溫放置48 h，取出，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液（1 mol/L鹽酸溶液、水）1 ml，得約80 %濃度供試品溶液。

2.3.2 高溫（光照）破壞 取本品及苯扎氯銨空白各適量，分別置安瓿（石英器皿）中，密封，于60 ℃烘箱（照度為3500 lx日光燈）中放置48 h，取出，放冷。

2.3.3 試驗結果 溶劑及空白溶液對本品中苯扎氯銨測定無干擾，破壞試驗后空白溶液在苯扎氯銨峰處無新的色譜峰。由表1可見，破壞后供試品中苯扎氯銨色譜峰純度角均小于純度閾值。

表1 專屬性試驗結果

2.4 耐用性試驗

根據(jù)美國藥典色譜條件系統(tǒng)適用性要求，對流動相pH值、緩沖鹽濃度及比例、檢測波長、進樣體積、柱溫、色譜柱及流速進行考察。結果見表2。

表2 耐用性試驗結果

由表2可見，變化前后，各色譜條件下供試品中苯扎氯銨含量測定結果的RSD為0.3 %～1.6 %（n=6），對照品溶液分離度及拖尾因子均符合要求。

2.5 線性

精密量取苯扎氯銨適量，置入100 ml量瓶，加水定量稀釋制成每1 ml中含0.6 mg溶液，作為儲備液。精密量取儲備液適量，分別加水定量稀釋制成每1 ml含15，22.5，30，36，45 μg溶液，作為線性溶液。精密量取各線性溶液80 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。用峰面積（Y）對線性溶液濃度（X）進行線性回歸，線性方程為Y= 4994.9X-2248.1，相關系數(shù)r=0.9999。

2.6 準確度試驗

取苯扎氯銨對照品適量，用空白溶液制成50 %，100 %和150 %苯扎氯銨濃度水平的溶液，作為供試品溶液。另精密量取苯扎氯銨對照品適量，加水定量稀釋制成每1 ml中含30 μg溶液，作為對照品溶液。每種濃度水平的溶液分別制備3份。各濃度水平的回收率見表3。結果顯示回收率良好。

表3 準確度試驗結果

2.7 精密度試驗

2.7.1 進樣精密度 取對照品溶液，連續(xù)進樣6次，計算峰面積及保留時間的RSD。苯扎氯銨峰面積的RSD為0.4 %，峰1保留時間的RSD為0.2 %，峰2保留時間的RSD為0.2 %。

2.7.2 重復性 取本品適量，作為供試品溶液，平行制備6份；另精密量取苯扎氯銨對照品適量，加水定量稀釋制成每1 ml中含30 μg溶液，作為對照品溶液。6份供試品中苯扎氯銨含量測定結果的RSD為0.4 %。

2.7.3 中間精密度 由不同分析人員在不同的日期使用不同的儀器進行重復性試驗。試驗者I和試驗者II的共12份供試品溶液中苯扎氯銨含量測定結果的RSD為0.8 %，二者的平均一致性為99.6 %。

2.8 范圍

根據(jù)線性、準確度、精密度等試驗結果，確定本法的適用范圍為50 %～150 %（以相當于供試品溶液濃度百分比計）。

3 討論

（1）苯扎氯銨系廣譜殺菌劑，是滴眼液中比較常見的防腐劑，化學名稱為氯化二甲基芐基烴銨，屬季銨基類化合物。中國藥典收載的妥布霉素滴眼液與硫酸新霉素滴眼液質(zhì)量標準中均有苯扎氯銨含量測定方法，二者色譜條件完全一致，但是色譜條件中添加了掃尾劑三乙胺以減小峰拖尾，由于三乙胺會對色譜柱的性質(zhì)造成一種不可逆轉的改變[7]，因此使其不再適合應用于流動相中不含三乙胺成分的檢測，所以本品參照《美國藥典》中苯扎氯銨的測定方法，優(yōu)化后確定了本品中苯扎氯銨的測定方法，經(jīng)方法學驗證，該方法可行。

（2）苯扎氯銨為氯化烷基二甲基芐銨的混合物，主要由3種正烷烴基（n-C12H25、n-C14H29、n-C16H33）取代的二甲基芐基氯化銨的同系物組成[8]，采用中檢院對照品在我們的色譜條件下有3個色譜峰，而樣品只有一個色譜峰，可能與國產(chǎn)原料有關。實際測定時，保留時間為為3.8 min的色譜峰信噪比S/N約為6.7，低于定量限，為準確定量，在計算本品中苯扎氯銨含量時，不將此峰計算在內(nèi)。按同系物峰面積的和值計算含量。典型圖譜見圖1～2 。

圖1 苯扎氯銨中檢院對照品

圖2 苯扎氯銨國產(chǎn)原料