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        Sphk1拮抗劑的研究進(jìn)展

        2019-11-05 11:34:16楊皓然楊新美劉愛芹姚慶強(qiáng)
        食品與藥品 2019年5期
        關(guān)鍵詞:拮抗劑激酶癌細(xì)胞

        楊皓然 ,楊新美,劉愛芹 ,劉 波 *,姚慶強(qiáng) *

        (1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250200;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點實驗室,山東省罕少見病重點實驗室,山東 濟(jì)南 250062;3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院) 藥學(xué)部,山東 濟(jì)南 250014)

        細(xì)胞內(nèi)鞘脂代謝產(chǎn)物如神經(jīng)酰胺(ceramide,Cer),鞘氨醇(sphingosine,Sp)和鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)(見圖1),是重要的信號分子[1],在調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、遷移、分化及程序性凋亡等生命活動中發(fā)揮著重要作用。Cer和Sp是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子,能抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而S1P則是重要的存活因子(survival factor),能促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡[2]。細(xì)胞內(nèi)Cer,Sp和S1P通過主要由鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)參與的酶促反應(yīng)維持動態(tài)平衡。已有研究表明,SphK1的異常與多種疾病的發(fā)生有關(guān),包括鐮狀細(xì)胞病[3]、癌癥[4]、動脈粥樣硬化[5]、哮喘[6]等。近年,SphK1在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的重要作用被逐漸揭示,針對SphK1靶點的藥物設(shè)計、開發(fā)也成為國內(nèi)外研究的熱點[7]。本文就SphK1的結(jié)構(gòu)、功能及在研SphK1拮抗劑進(jìn)行綜述,期望為新型SphK1拮抗劑的研究開發(fā)提供參考。

        圖1 Cer(1),Sp(2)和S1P(3)的結(jié)構(gòu)

        1 SphK1及其促進(jìn)細(xì)胞增殖機(jī)制

        SphK是一種高度保守的ATP依賴脂質(zhì)激酶,由Olivera等于1998年首次從大鼠腎臟細(xì)胞中提取[8]。目前,在哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)有SphK1和SphK2兩種亞型,其在酵母和植物中也均有表達(dá)[9-10]。人的SphK1基因位于17號染色體(17q25.2)上,相對分子質(zhì)量(Mr)為42×103,主要分布于腦、心、脾、肺、腎及胸腺細(xì)胞中。SphK2基因位于19號染色體(19q13.2),SphK2比SphK1多200個氨基酸,Mr為63×103,主要分布于腎臟和肝臟肝細(xì)胞中[11]。SphK1和SphK2都有C1~C5共5個保守序列,具有高度同源性,在N端和C端分別有47 %和43 %的序列完全相同[12]。SphK1的主要功能是磷酸化Sp生成S1P,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成,抑制凋亡。SphK2 的具體作用還不十分明確,通過RNAi技術(shù)干擾HEK293細(xì)胞的SphK2,能阻斷血清撤離或藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13],但近期也有研究發(fā)現(xiàn),選擇性抑制SphK2的活性對肝癌[14]、多發(fā)性骨髓瘤[15]等多種癌癥有一定的治療作用,由于其作用機(jī)制的復(fù)雜性,針對 SphK2的拮抗劑還在研究中。

        2013 年,人類SphK1晶體結(jié)構(gòu)被解析出來,為基于靶點結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計提供了有力的科學(xué)依據(jù)[16]。人類SphK1(見圖2)是含有384個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),包含9個α螺旋,17個β折疊和1個310螺旋。SphK1可分為兩個結(jié)構(gòu)域,其中,N-末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)含6個α螺旋(α1~ α6)和6個β折疊(β1~β5,β17)。NTD的中心部位是4個平行β-折疊(β2,β1,β3,β4)和2個反平行β-折疊(β5,β17),β-折疊的兩側(cè)分別被α2,α3,α4和α1,α5,α6包圍。C-末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD)是底物結(jié)合域,含有3個α螺旋(α7~α9),1個310-α螺旋和11個β折疊(β6-β16)。CTD中心部位的5個反平行β折疊(β7,β6,β16,β13,β9)位于CTD背面,另外6個反平行β折疊(β15,β14,β8,β10,β11,β12)位于CTD的前面,3個α螺旋(α7~α9),310-α螺旋和1個長的卷曲環(huán)區(qū)(coiled loop)分別位于11個β折疊的前面和背面,因此SphK1的配體結(jié)合域整體上呈一個“J形”口袋(見圖2)。

        圖2 SphK1的結(jié)構(gòu)和“J形”疏水口袋

        人體內(nèi)鞘磷脂(sphingomyelin)的代謝途徑為:細(xì)胞膜外的鞘磷脂(sphingomyelin)通過水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為Cer,然后Cer通過去?;饔蒙蒘p,最后SphK1磷酸化Sp生成S1P。游離S1P可快速被S1P磷酸酶(S1P-phosphatase,SPP)降解成Sp或被S1P裂解酶(S1P lyase)不可逆地降解為軟脂醛(palmitaldehyde)和磷酸膽堿(phosphoryl choline)。目前的研究認(rèn)為S1P發(fā)揮生物學(xué)功能主要通過兩種方式,一種為行使細(xì)胞外第一信使功能,即S1P以自分泌或旁分泌的方式分泌到細(xì)胞外,與G蛋白偶聯(lián)受體上的相應(yīng)S1P受體(S1P receptor,S1PR)結(jié)合產(chǎn)生“由內(nèi)而外”的信號通路,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)功能[17-18]。另一種為行使細(xì)胞內(nèi)第二信使功能,即胞內(nèi)S1P直接作用于細(xì)胞內(nèi)的不同蛋白靶點介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)[19-20](見圖3)。

        2 SphK1拮抗劑

        圖3 Sphk1-S1P-S1PR信號通路

        SphK1小分子拮抗劑的開發(fā)研究始于2003年[19],其作用機(jī)制多數(shù)是通過與SphK1的“J形”口袋結(jié)合來調(diào)節(jié)SphK1的功能[7]。目前在研的SphK1拮抗劑根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為鞘氨醇類和非脂質(zhì)類。近年,一些天然產(chǎn)物也被發(fā)現(xiàn)具有抑制SphK1的作用。本文總結(jié)了近年具有代表性的SphK1拮抗劑,并將各拮抗劑匯總見表1。

        表1 SphK1拮抗劑匯總

        注:ND:未測定

        2.1 鞘氨醇類SphK1拮抗劑

        鞘氨醇類SphK1拮抗劑可看作是Sp的衍生物或類似物。該類拮抗劑主要針對Sp的極性頭部、連接鏈、疏水尾部3部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、改造(見圖4)。

        圖4 鞘氨醇結(jié)構(gòu)及其關(guān)鍵化學(xué)區(qū)域

        SK1-I(BML-258)是同時對Sp 的疏水尾部和連接鏈進(jìn)行改造而得到的化合物,也是第一個水溶性選擇性SphK1拮抗劑。與通常在聚乙二醇或DMSO中遞送的其他鞘氨醇類拮抗劑不同,SK1-I具有優(yōu)異的溶解性,可以鹽水溶液的形式給藥[7]。SK1-I能選擇性抑制SphK1的活性,對SphK2及其他激酶無抑制作用[21]。Sk1-I在白血病和U937細(xì)胞中可通過影響細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)和Akt信號來有效抑制腫瘤生長[21],在乳腺癌細(xì)胞中,Sk1-I可降低胞內(nèi)S1P水平,也發(fā)揮出一定的抗增殖活性[22]。最近也有研究表明Sk1-I能通過提高抑癌蛋白TP53的活性而調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[23]。

        Sp的極性頭部OH部分能被SphK1磷酸化后發(fā)揮信使作用,因此去除OH可能獲得活性較好的SphK1拮抗劑,基于該思路得到了化合物Enigmol[24]。Enigmol不能被SphK1磷酸化,且對多種癌細(xì)胞表現(xiàn)出有效的抗癌活性,在小鼠結(jié)腸癌和前列腺癌的異種移植瘤模型中,口服給予Enigmol對兩種癌細(xì)胞均顯示出顯著的生長抑制[25]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),對Enigmol進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到的化合物對多種癌細(xì)胞也具有良好的抗增殖活性[24]。于Enigmol的長鏈?zhǔn)杷膊恳雰蓚€氟原子,得到CF2-Enigmol,其在小鼠體內(nèi)實驗中除了在抗增殖方面較親代具有更好的效果,其在肺、腦和腎中具有較高的血藥濃度,因此對于治療肺、腦、腎組織中的實體瘤具有重要的意義[26]。

        對Sp的連接鏈的氨基部分進(jìn)行改造,分別得到化合物Dimethylsphingosine(DMS)和LCL351。DMS是SphK1、SphK2的共同拮抗劑,對蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),神經(jīng)酰胺激酶 (ceramide kinase,CK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)等多種重要蛋白激酶都具有抑制作用,選擇性較低。DMS在多種癌細(xì)胞中均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27],但也已被證實在較低濃時反而會增強(qiáng)SphK1的活性[28],另外,紅細(xì)胞溶血和肝毒性等副作用也限制了其在臨床上的應(yīng)用[29]。LCL351是選擇性的SphK1拮抗劑,在炎癥性腸病的小鼠模型中,LCL351可選擇性地抑制SphK1的活性而減少炎癥物的產(chǎn)生,且在體內(nèi)未見任何不良反應(yīng)[30]。但作為抗腫瘤藥,LCL351在體內(nèi)生物利用度不高,藥理活性也并不理想[31]。

        Safingol可看作是Sp的疏水尾部雙鍵還原后得到的化合物,也能同時抑制SphK2、PKC和CK等激酶的活性,選擇性較低[29]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中,Safingol通過引起細(xì)胞自噬抑制癌細(xì)胞增殖[32],對患有晚期實體瘤的患者進(jìn)行的I期臨床試驗表明,Safingol可安全地與順鉑聯(lián)合給藥,僅顯示出可逆的劑量依賴性肝毒性[33]。

        近年,基于計算機(jī)輔助藥物設(shè)計和構(gòu)效關(guān)系研究設(shè)計合成的SphK1拮抗劑也在蓬勃發(fā)展。為了獲得選擇性更高的化合物,在Sp的基本骨架上引入脒基,由此得到了一系列脒類化合物,該類化合物對SphK1的選擇性高于SphK2,并且對人PKC等多種激酶均無抑制作用[34]。VPC96091在納摩爾濃度下即可顯著降低U937細(xì)胞胞內(nèi)S1P的水平,升高Sp和Cer水平,但僅在較高濃度(10 μmol/L) 時才會對該細(xì)胞中的ERK和Akt信號傳導(dǎo)產(chǎn)生影響[7],抗增殖作用并不理想。在脒基的基礎(chǔ)上,繼續(xù)引入其他官能團(tuán)如噁唑,得到化合物11g,該化合物對于SphK1的選擇性是SphK2的705倍,是目前已知的選擇性最好的拮抗劑[35]。雖然該類化合物的選擇性和活性都很出色,但普遍存在體內(nèi)代謝穩(wěn)定性差,半衰期較短的缺點[34-35],且該類化合物的藥動學(xué)性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究[36]?;跇?gòu)效關(guān)系研究設(shè)計合成的化合物RB-005在肺動脈平滑肌細(xì)胞中可降低SphK1基因的表達(dá),同時可誘導(dǎo)人肺動脈平滑肌細(xì)胞中SphK1蛋白酶體降解,可作為SphK1拮抗劑研發(fā)的理想先導(dǎo)物[37]。

        2.2 非脂質(zhì)類SphK1拮抗劑

        SKI-II是一類最早發(fā)現(xiàn)的非脂質(zhì)類拮抗劑,對SphK1、SphK2都具有抑制活性,對PKC,ERK和PI3K等激酶無抑制作用,并能通過降低細(xì)胞內(nèi)S1P的水平,升高Cer和Sp的水平,誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡[38-39],此外,SKI-II還被證實可增強(qiáng)多柔比星等幾種抗癌藥物對癌細(xì)胞的作用效果[40-41],用SKI-II處理細(xì)胞也引起SphK1蛋白酶體降解,這有助于增強(qiáng)SKI-II降低細(xì)胞內(nèi)S1P的能力[42]。在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中,SKI-II有良好的口服生物利用度,但“脫靶”(off-target)效應(yīng)限制了其在臨床中的應(yīng)用[43]。

        美國的安進(jìn)(Amgen)公司基于構(gòu)效關(guān)系研究將SKI-II和Sp 的骨架進(jìn)行拼接,開發(fā)了一系列高效的鞘氨醇激酶拮抗劑,代表化合物為化合物23,該化合物具有良好的物理化學(xué)和藥動學(xué)性質(zhì),小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),雖然該化合物可有效抑制SphK1的活性,但并不能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,更深層的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究[44]。

        SKI-178是對SKI-II的同系化合物SKI-I進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而產(chǎn)生的,對SphK1、SphK2都具有抑制活性。SKI-178在較低濃度時即可誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡[45],目前還沒有證據(jù)表明SKI-178會對PKC等蛋白激酶產(chǎn)生抑制作用。HL-60細(xì)胞中,SKI-178可加速促存活因子Bcl-2,Bcl-xl 和 Mcl-1的降解而發(fā)揮抗增殖作用[45]。AML細(xì)胞中,SKI-178除抑制SphK,還可破環(huán)細(xì)胞中的微管網(wǎng)絡(luò),從而誘導(dǎo)AML細(xì)胞的凋亡[46]。SKI-178在AML小鼠模型中具有良好的耐受性,安全有效,可作為多靶點抗癌治療劑進(jìn)一步發(fā)展[46]。

        PF-543是高選擇性的SphK1拮抗劑,對SphK1的選擇性是SphK2的130倍,與RB-005和SKI-II一樣,PF-543在發(fā)揮抑制作用的同時,也同時誘導(dǎo)SphK1蛋白酶體降解[47]。PF-543對原發(fā)性結(jié)直腸癌細(xì)胞具有抗增殖和細(xì)胞毒活性[48]。長時間較高劑量下PF-543可通過引起細(xì)胞自噬來誘導(dǎo)頭頸部鱗狀癌細(xì)胞的凋亡[49]。PF-543在鐮狀細(xì)胞性貧血小鼠模型中有效阻斷鐮狀細(xì)胞、溶血和炎癥的產(chǎn)生,并在小鼠肺動脈高壓低氧模型中對心臟具有一定的保護(hù)作用[50]。除了發(fā)揮抗腫瘤作用外,PF-543在對抗炎癥和自身免疫疾病方面的重要作用也應(yīng)得到重視。

        SK1-5c是一種選擇性SphK1拮抗劑,對PKC等蛋白激酶均無抑制作用[51]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中,SK1-5c可降低Akt信號的傳導(dǎo),抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[52],SK1-5c也可誘導(dǎo)MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡,并在小鼠MDA-MB-231異種移植瘤模型中使腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制[53]。雖然SK1-5c是選擇性SphK1拮抗劑,但其對其他脂質(zhì)激酶、蛋白激酶和其他鞘脂代謝酶的影響需進(jìn)一步研究。

        MP-A08是通過計算機(jī)對接篩選得到的ATP競爭性SphK拮抗劑[54],其對SphK1和SphK2均有抑制作用。MP-A08不抑制人神經(jīng)酰胺激酶(ceramide kinase,CK)和二?;视图っ福╠iacylglycerol kinase,DAGK)等激酶的活性,并能降低S1P的水平,升高Sp和Cer的水平,但其并不誘導(dǎo)SphK1蛋白酶體降解。在小鼠肺癌異種移植瘤模型中,MP-A08能和ATP競爭鞘氨醇激酶上的結(jié)合位點,進(jìn)而阻斷促增生信號通路,減少腫瘤血管的形成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[54]。由于MP-A08相對于其他已知的SphK1拮抗劑有不同的作用模式,因而可為靶向SphK1的抗癌藥物的研究提供新的思路。

        2.3 天然產(chǎn)物類SphK1拮抗劑

        天然產(chǎn)物一直是藥物和藥物先導(dǎo)物的重要源泉。目前發(fā)現(xiàn)一些從細(xì)菌和真菌中分離得到的天然產(chǎn)物,對鞘氨醇激酶也具有抑制作用。從海洋細(xì)菌中分離得到的B-5354c,可同時抑制SphK1和SphK2的活性,并能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞(PC-3)凋亡,在原位異種移植的PC-3細(xì)胞模型中與喜樹堿發(fā)揮協(xié)同作用,增強(qiáng)喜樹堿的抗腫瘤活性[55]。從真菌Trichopezizella barbata的培養(yǎng)液中分離得到的F-12509A,可同時抑制SphK1和SphK2的活性;HL-60細(xì)胞中,F(xiàn)-12509A可通過抑制SphK1來阻斷S1P的產(chǎn)生,且無論多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)基因表達(dá)如何,F(xiàn)-12509A均能在低濃度促進(jìn)下誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[56]。雖然天然產(chǎn)物對SphK的選擇性不太好,但它們可作為潛在的先導(dǎo)物用于開發(fā)更有效和特異性的SphK1拮抗劑。

        天然產(chǎn)物 pachastrissamine(又名Jaspine B)是2002年及2003年從海綿中分離得到的一類無水鞘氨醇類化合物[57-58],其在結(jié)構(gòu)上可看作 Sp的分子內(nèi)脫水產(chǎn)物。佳司派恩(Jaspine B)具有順式三取代的四氫呋喃環(huán)骨架,能同時抑制SphK1、SphK2的活性并對人類P388、A549、HT29、MEL28等多種癌細(xì)胞有細(xì)胞毒活性[59-60]。目前Jaspine B及其2,3,4-位異構(gòu)體已全部合成出來[61],在測試中發(fā)現(xiàn),其2位異構(gòu)體對SphK1的選擇性最高,可作為先導(dǎo)物進(jìn)行改造、優(yōu)化。目前,本課題組正利用分子對接等合理藥物設(shè)計方法對2-位異構(gòu)體進(jìn)行衍生物設(shè)計、合成及生物活性研究,期望得到靶向SphK1的抗腫瘤臨床候選藥物。

        3 結(jié)語與展望

        SphK1與腫瘤等疾病之間聯(lián)系密切,可作為癌癥治療的理想靶標(biāo)。近年,SphK1拮抗劑發(fā)展迅速,特別是計算機(jī)輔助藥物設(shè)計和構(gòu)效關(guān)系研究的興起,為這類藥物的設(shè)計提供了更加科學(xué)的指導(dǎo)。但在研 SphK1 拮抗劑的選擇性、體內(nèi)活性或藥動學(xué)性質(zhì)限制了其臨床應(yīng)用,目前還沒有上市及進(jìn)入臨床試驗的候選藥物,因此設(shè)計開發(fā)對 SphK1 具有高親和力的特異性拮抗劑具有廣闊的發(fā)展空間和重要的臨床意義。

        4 致謝

        感謝山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院院級科技計劃(2016-5),山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程經(jīng)費支持。

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