崔 靜，于小童

（淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086）

格列吡嗪的化學(xué)名為1-環(huán)己基-3-{4-[2-(5-甲基吡嗪-2-酰胺)-乙基]苯磺酰}脲，是美國(guó)輝瑞公司開發(fā)的第二代磺酰脲類口服降糖藥，1984年在美國(guó)上市[1]。格列吡嗪主要應(yīng)用于2型糖尿病患者的治療，其作用機(jī)制為促胰島β細(xì)胞分泌胰島素[2]。

《中國(guó)藥典》2015年版二部收載了格列吡嗪及其片劑，其有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)均只檢查4-[2-（5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基）乙基]苯磺酰胺（雜質(zhì)Ⅰ）的含量[3]，而可能存在的5-甲基吡嗪-2-羧酸既是格列吡嗪合成時(shí)使用的起始物料[1]，又是格列吡嗪酰胺鍵斷裂時(shí)產(chǎn)生的雜質(zhì)[4]，因此，監(jiān)控5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量對(duì)于格列吡嗪片的質(zhì)量控制非常有必要。由于5-甲基吡嗪-2-羧酸的酸性強(qiáng)，中國(guó)藥典、美國(guó)藥典、歐洲藥典等收載的有關(guān)物質(zhì)檢查方法中的色譜系統(tǒng)中均不適于該雜質(zhì)的含量測(cè)定，因此，本文建立了反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量[5-8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 高效液相色譜儀，包含四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫）；CP225D電子天平（德國(guó)賽多利斯）；ML204電子天平（瑞士梅特勒）。

1.2 試藥

5-甲基吡嗪-2-羧酸（Sigma-Aldrich公司）；格列吡嗪片（仁和堂藥業(yè)，批號(hào)：170901，171101，180504，規(guī)格：5 mg）；甲醇（色譜純，默克股份兩合公司）；10 %四丁基氫氧化銨溶液（分析純，上海麥克林）；磷酸二氫鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；流動(dòng)相A：50 mmol/LNaH2PO4溶液（含0.05 %四丁基氫氧化銨），流動(dòng)相B：甲醇，按表1梯度洗脫。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 取5-甲基吡嗪-2-羧酸對(duì)照品約25 mg，精密稱定，用5 %甲醇溶液溶解并稀釋制成每1 ml含12.5 μg的溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品貯備液，用5 %甲醇溶液溶解并稀釋制成每1 ml含0.5 μg的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取格列吡嗪片10片，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于格列吡嗪25 mg），置入50 ml量瓶，加5 %甲醇溶液適量，強(qiáng)力振搖并超聲15 min使5-甲基吡嗪-2-羧酸充分溶解，再加5 %甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取格列吡嗪片10片，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于格列吡嗪25 mg），置入50 ml量瓶，用對(duì)照品溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取空白溶劑（5 %甲醇溶液）、系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果：系統(tǒng)適用性溶液中主峰無(wú)相鄰雜質(zhì)峰，空白溶劑對(duì)5-甲基吡嗪-2-羧酸測(cè)定無(wú)干擾，該色譜條件適用于5-甲基吡嗪-2-羧酸含量的測(cè)定。

圖1 HPLC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品25.13 mg，用5 %甲醇溶液溶解并稀釋制成0.05026，0.1005，0.2513，0.5026，1.0052，1.5078，2.0104 μg/ml的溶液，分別精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=79 027.3X+6355.88（r=0.9999），表明在0.05026～2.0104 μg/ml范圍內(nèi)，5-甲基吡嗪-2-羧酸濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 定量限和檢測(cè)限 用5 %甲醇溶液將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋制成一系列不同濃度，分別精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。當(dāng)信噪比約為10時(shí)，作為定量限濃度。當(dāng)信噪比約為3時(shí)，作為檢出限濃度。定量限為0.05026 μg/ml，檢測(cè)限為0.01508 μg/ml。

2.3.4 系統(tǒng)精密度試驗(yàn) 取定量限溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，5-甲基吡嗪-2-羧酸峰面積RSD為0.5 %（n=6），表明精密度良好。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液于室溫下放置，分別在0，2，4，6，8 h時(shí)精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。對(duì)照品溶液主成分峰面積的RSD為0.8 %，系統(tǒng)適用性溶液主成分峰面積的RSD為0.3 %，溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 準(zhǔn)確度 取格列吡嗪片（批號(hào)：170901）適量，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于格列吡嗪25 mg，5-甲基吡嗪-2-羧酸含量為0.0080 %），置入50 ml量瓶，平行稱取9份，每3份為一組，分別精密加對(duì)照品貯備液1，2，3 ml，加5 %甲醇溶液適量，強(qiáng)力振搖并超聲15 min，使5-甲基吡嗪-2-羧酸充分溶解，再用5 %甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平均回收率為99.20 %，RSD為0.9 %，表明準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表2。

2.3.7 重復(fù)性 照2.2.3項(xiàng)方法，平行制備6份供試品溶液。精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。5-甲基吡嗪-2-羧酸平均含量為0.041 %，RSD為0.6 %，重復(fù)性良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

取3批格列吡嗪片，批號(hào)分別為170901、171101、180504，照2.2.3項(xiàng)方法，配制供試品溶液，測(cè)得結(jié)果分別為0.0080 %，0.0084 %，0.0079 %。

3 討論

3.1 用二極管陣列檢測(cè)器提取5-甲基吡嗪-2-羧酸峰的紫外光譜，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為214 nm和276 nm。與214 nm相比276 nm波長(zhǎng)處特征峰明顯，故選擇276 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 本文建立的反相離子對(duì)高效液相色譜法，在0.05026～2.0104 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.01508 μg/ml，本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度好、結(jié)果可靠。較使用色譜用水（用醋酸調(diào)pH 3.5）為流動(dòng)相A、乙腈為流動(dòng)相B[8]，本文的色譜條件分離效果更好。國(guó)內(nèi)無(wú)關(guān)于格列吡嗪片中5-甲基吡嗪-2-羧酸雜質(zhì)的檢測(cè)方法的參考文獻(xiàn)。經(jīng)驗(yàn)證，本文所建立的方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度好、結(jié)果可靠，適合用于格列吡嗪片中微量雜質(zhì)5-甲基吡嗪-2-羧酸的測(cè)定。