張秀華，劉 飛, ，劉英梅，陳 勉，劉 霞，劉金明，凌沛學, ，王鳳山

（1.山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室 博士后科研工作站，山東 濟南 250101；2.山東大學 藥學院，山東 濟南 250101；3.浙江賽靈特醫(yī)藥科技有限公司，浙江 杭州 311100）

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一種多功能生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員，能誘導(dǎo)血管周圍游動的未分化間充質(zhì)細胞向骨系細胞方向轉(zhuǎn)化，在骨骼（原位）或骨骼以外組織中（異位）產(chǎn)生新骨[1]。

目前己知的骨形成蛋白有30多種，許多BMP亞型已顯示骨誘導(dǎo)活性，但其中研究最為充分的為BMP-2和BMP-7，且只有這兩種骨形成蛋白被開發(fā)應(yīng)用于臨床，是與新骨生成關(guān)系密切、最有效的誘導(dǎo)骨再生的骨形態(tài)發(fā)生蛋白[2]。BMP在結(jié)構(gòu)上類似，是由2 條多肽鏈通過二硫鍵結(jié)合的二聚體分子[3]，其特征是：由7個保守的半胱氨酸將整個分子折疊成一種獨特的三維結(jié)構(gòu)，稱為胱氨酸結(jié)（cystine-knot），包含3對鏈內(nèi)二硫鍵和一對鏈間二硫鍵。BMP 屬于多功能細胞因子，研究證實BMP不僅與骨骼的形成有關(guān)，還與細胞的增殖、分化、凋亡、遷移有關(guān)，此外 BMP 還與組織器官的形成和發(fā)育如胚層的形成、肢體形成和心血管、呼吸、胃腸、泌尿及生殖、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生等基本的發(fā)育過程密切相關(guān)，在發(fā)育期和成年后的各個時期都有不同影響[4-6]，研究還證實 BMP與糖物質(zhì)代謝有關(guān)[7]，可通過調(diào)控糖代謝過程中關(guān)鍵酶的表達、促進胰島素合成及分泌、增加胰島素敏感性等方式調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖平衡。

BMP-2為疏水性酸性糖蛋白，由10余種氨基酸組成，水溶性差，酸性條件下穩(wěn)定，二聚體形式為其活性形式。1996 年德國科學家Ruppert等用大腸桿菌系統(tǒng)成功獲得有良好活性的rhBMP-2m，并就此在歐洲申請了專利，2002年7月美國食品和藥物管理局（FDA）批準將rhBMP應(yīng)用于脊柱融合[8-9]。美敦力公司產(chǎn)品Infuse?骨移植物隨后上市。我國用大腸桿菌系統(tǒng)表達生產(chǎn)的rhBMP-2m也于 2004 年通過臨床試驗，以醫(yī)療器械的形式被批準生產(chǎn)投放市場，用于骨缺損的治療。

由于提取困難且成本較高，目前BMP-2蛋白的生產(chǎn)多以基因工程方法在大腸桿菌中生產(chǎn)。但由于其疏水性較強，rhBMP-2在大腸桿菌中多以不溶性的包涵體形式表達，因此獲得一株表達量高且復(fù)性方法簡單、收率高的重組工程菌是近十幾年研究的熱點。本項目通過大腸桿菌密碼子偏好性對密碼子進行優(yōu)化，構(gòu)建了一株高效表達的產(chǎn)hBMP-2重組菌株。該菌株經(jīng)高密度發(fā)酵后包涵體得量高，通過稀釋復(fù)性法對包涵體進行復(fù)性，肝素柱親和純化方法對目的蛋白進行純化，最終可得電泳純蛋白。本項目中建立的方法簡單易行，放大簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料

1.1 試劑

限制性內(nèi)切酶（NdeI，XhoI）（NEB）；T4 DNA連接酶（NEB）；蛋白質(zhì)分子量標記（Fermentas）；PfuDNA 聚合酶（Fermentas）；PCR引物，DNA分子量標記，質(zhì)粒抽提試劑盒（上海生工）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工）；DNA膠回收試劑盒（上海生工）；肝素親和層析柱（GE公司）；超濾膜（Millipore）；超濾管（Millipore）；堿性磷酸酶測定試劑盒（北京索萊寶）；骨優(yōu)導(dǎo)（杭州九源）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 質(zhì)粒與菌株

pET-28a(+)質(zhì)粒，E.coliTop10，E.coliBL21（DE3）菌株及C2C12細胞均為本實驗室保藏。

1.3 培養(yǎng)基

液體LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；固體LB培養(yǎng)基含1.5 %～2 %瓊脂粉；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖5，酵母提取物5，(NH4)2HPO44， KH2PO413.3，檸檬酸1.7，MgSO4·7H2O 1.2，微量元素：FeSO4·7H2O 1，CaCl20.2，ZnSO4·7H2O 2.25 g/L，MnSO4·4H2O 0.5，(NH4)6Mo7O240.1， Na2B4O7·10H2O 0.23 g/L，CuSO4·5H2O 0.1；補料培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖600，MgSO4·7H2O 20，酵母提取物100。

2 方法

2.1 基因的獲得

查閱NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得人BMP-2（Genebank P12643.1）成熟肽序列，堿基序列345 bp，編碼115個氨基酸。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對BMP-2成熟肽編碼序列進行密碼子優(yōu)化，并分別在上下游兩端添加NdeI、XhoI酶切位點，采用全基因合成方法獲得優(yōu)化后BMP-2基因。

2.2 BL21-pET28-rhBMP-2重組菌株的構(gòu)建

PCR擴增得到BMP-2基因片段，純化后與pET-28a(+)質(zhì)粒分別用NdeI、XhoI進行雙酶切，切膠回收后用T4 DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒pET28-rhBMP-2，CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coliTOP 10感受態(tài)細胞。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)單酶切、PCR、測序驗證正確后，提取pET28-rhBMP-2重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細胞，得BL21-pET28-rhBMP-2工程菌株。

2.3 rhBMP-2重組蛋白的表達

工程菌株 LB液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)后，以4 %接種量接種至含50 ml LB培養(yǎng)基的250 ml搖瓶中， 37 ℃培養(yǎng)4 h，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導(dǎo)，并降溫至28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h。8000 r/min離心5 min收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸后進行超聲破碎，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測目的蛋白表達情況。

按相同接種量，利用發(fā)酵培養(yǎng)基進行1 L發(fā)酵罐小試，控制發(fā)酵溫度37 ℃，pH 7.0，溶氧25 %，當溶氧快速上升且轉(zhuǎn)速快速下降時開始補料，添加IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后降低溫度至28 ℃。繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵期間每隔12 h取樣，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況，確定最佳發(fā)酵時間。

2.4 rhBMP-2包涵體的復(fù)性

收集發(fā)酵菌體，超聲破碎后12 000 r/min離心20 min得到包涵體，利用包涵體洗滌液（pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl ，0.5 mmol/L EDTA，2 % Triton X-100）反復(fù)洗滌包涵體3次。然后用包涵體裂解液[6 mol/L鹽酸胍，pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl ，20 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），1 mmol/L EDTA]將包涵體裂解為終濃度35 mg/ml。采用稀釋復(fù)性法進行復(fù)性，復(fù)性液[1 mmol/L 氧化型谷胱甘肽（GSSG），2 mmol/L 還原型谷胱甘肽（GSH），pH 8.0 50 mmol/L Tris-HCl ，5 mmol/L EDTA，0.5 mol/LN-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸（CHES）]中蛋白終濃度為500 mg/L，常溫復(fù)性4 d，SDS-PAGE檢測蛋白復(fù)性情況。

2.5 rhBMP-2蛋白的純化

由于BMP-2前端序列中含肝素結(jié)合位點，可用肝素親和層析柱對其進行純化。親和層析所用緩沖液為4 mol/L尿素、pH 8.0 20 mmol/L Tris，洗脫單聚體所用緩沖液為4 mol/L 尿素、 pH 8.0 20 mmol/L Tris、400 mmol/L NaCl，洗脫二聚體所用緩沖液為4 mol/L 尿素、pH 8.0 20 mmol/L Tris、800 mmol/L NaCl。收集有活性的二聚體部分，用pH 4.0醋酸鹽緩沖液透析除鹽，透析后樣品真空冷凍干燥。

2.6 rhBMP-2細胞活性測定

生長良好的C2C12細胞按1×105個/孔接種于24孔板，37 ℃、5 % CO2預(yù)培養(yǎng)24 h，更換新鮮DMEM培養(yǎng)基并分別加入不同濃度rhBMP-2（500 ng/ml、1000 ng/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 d，依照堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒說明檢測ALP活性。以骨優(yōu)導(dǎo)為陽性對照。

3 結(jié)果

3.1 基因的獲得

采用PCR擴增BMP-2基因切膠回收片段進行1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可見擴增得到的目的基因片段長度約350 bp，與理論值一致。

圖1 hBMP-2基因片段瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

3.2 BL21-pET28-rhBMP-2重組菌株的構(gòu)建

提取Top10-pET28-rhBMP-2質(zhì)粒，XhoI單酶切、PCR驗證的1.0 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。由圖2可見，單酶切后的重組質(zhì)粒大小約5.7 kb，與空質(zhì)粒的差值與目的基因理論值一致。以重組子為模板，利用PCR擴增得到的目的基因，也與BMP-2基因大小相一致。測序結(jié)果也顯示插入的序列與設(shè)計的序列完全一致。

圖2 重組質(zhì)粒pET28-rhB MP-2單酶切及PCR驗證結(jié)果

3.3 rhBMP-2重組蛋白的表達

在搖瓶中對rhBMP-2蛋白進行表達，并進行超聲破碎，SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，超聲破碎上清中空載體對照與重組菌分子量無明顯區(qū)別；超聲破碎沉淀中，與空載體對照相比重組菌在分子量約13 kD處有明顯表達條帶。說明rhBMP-2蛋白在重組菌中以包涵體形式表達。

圖3 rhBMP-2表達情況SDS-PAGE分析

在1 L發(fā)酵罐中進行rhBMP-2蛋白的表達，分別在發(fā)酵4，17，29，41，53，65，77 h取樣，將樣品稀釋至相同的菌體濃度，進行全菌SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖4。發(fā)酵4 h開始補料并誘導(dǎo)，蛋白質(zhì)開始表達，發(fā)酵約29 h時目的蛋白表達量達最大，目的蛋白占胞內(nèi)總蛋白比例最高。隨著發(fā)酵時間延長，目的蛋白占胞內(nèi)總蛋白比例下降，但菌體密度增加，因此綜合考慮蛋白含量與菌體量及成本等因素，進行大規(guī)模發(fā)酵時可控制蛋白表達時間在40 h左右。發(fā)酵結(jié)束后菌體經(jīng)破碎、洗滌后稱重，1 L發(fā)酵罐中rhBMP-2包涵體濕重可達20 g/L。

圖4 rhBMP-2 1 L發(fā)酵罐中表達蛋白SDS-PAGE分析

3.4 rhBMP-2包涵體的復(fù)性檢測

非還原SDS-PAGE電泳檢測包涵體復(fù)性情況見圖5，通過灰度掃描確定復(fù)性率。結(jié)果顯示方法2.4項下復(fù)性液可有效復(fù)性包涵體，蛋白復(fù)性率達40 %以上。

3.5 rhBMP-2蛋白的純化

利用肝素親和層析柱對復(fù)性液純化，層析圖譜見圖6，峰1為穿透峰，峰2為400 mmol/L NaCl洗脫峰，峰3為800 mmol/L NaCl洗脫峰。分別收集穿透峰和洗脫峰，進行非還原SDS-PAGE電泳，檢測二聚體純化情況，結(jié)果見圖7。

圖5 rhBMP-2復(fù)性蛋白電泳圖

峰1為穿透峰，幾乎無蛋白質(zhì)流出，說明肝素柱能有效地與蛋白質(zhì)結(jié)合；峰2為單聚體，洗脫液中絕大部分蛋白質(zhì)為分子量小的單聚體；峰3為二聚體，洗脫液中二聚體蛋白純度達95 %以上，說明該條件下單聚體與二聚體可有效分離。為確認蛋白二聚體形式，將收集的峰3樣品分別加入含DTT和不含DTT的蛋白上樣緩沖液進行電泳，分別對應(yīng)泳道4、5。由圖7可見加入還原劑DTT后二聚體被還原成了單聚體，間接說明了該蛋白的二聚體形式。

圖6 rhBMP-2肝素親和層析圖譜

圖7 rhBMP-2純化結(jié)果SDS-PAGE分析

3.6 rhBMP-2細胞活性測定

C2C12細胞是成肌干細胞，在BMP-2作用下可向成骨細胞分化，分化后的成骨細胞可表達C2C12細胞內(nèi)沒有的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），因此ALP是成骨細胞的標志性酶，該檢測方法已成為BMP活性檢測的基本方法。

純化后的rhBMP-2活性結(jié)果見圖8。結(jié)果顯示制備的rhBMP-2具有與市售產(chǎn)品骨優(yōu)導(dǎo)相同的生物活性，能有效誘導(dǎo)C2C12細胞向成骨細胞分化，產(chǎn)生特異性ALP。

圖8 rhBMP-2與對照樣品骨優(yōu)導(dǎo)生物活性比較

4 討論

本項目中構(gòu)建的hBMP-2重組工程菌表達量高，1 L發(fā)酵液可得高純度包涵體20 g。王馥麗等[10]認為包涵體的純度會影響復(fù)性效果，需先對包涵體進行純化再裂解、復(fù)性，但本研究發(fā)現(xiàn)無需額外純化，經(jīng)簡單洗滌后即可對包涵體進行裂解復(fù)性，且復(fù)性效率大于40 %，優(yōu)于上述文獻報道的31 %。本研究為了得到高純度的二聚體進行后續(xù)實驗研究，采用親和層析對BMP-2進行純化，實驗也證實經(jīng)親和層析一步純化后，可將未復(fù)性的單體和復(fù)性成功的二聚體分離，且分離得到的二聚體純度在95 %以上，大大降低了工業(yè)生產(chǎn)成本。

本項目純化得到的二聚體溶液利用透析除鹽，超濾濃縮后再經(jīng)冷凍干燥，每升發(fā)酵液最終可得有活性的二聚體蛋白大于100 mg。凍干后的樣品經(jīng)活性檢測具有與市售產(chǎn)品骨優(yōu)導(dǎo)相同的生物活性，可與藥用明膠、大豆磷脂、羥基磷灰石等載體復(fù)合，進行新產(chǎn)品的開發(fā)，最終以醫(yī)療器械的形式生產(chǎn)投放市場，用于骨缺損的治療。