亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        肝腫瘤細(xì)胞干性與糖代謝特點(diǎn)的相關(guān)性研究

        2019-11-05 11:20:46李懿皞王蓓麗潘柏申
        中國(guó)癌癥雜志 2019年10期

        李懿皞,戴 謙,王蓓麗,潘柏申,郭 瑋

        復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200032

        近年來(lái),腫瘤的發(fā)病率和死亡率都在不斷地增長(zhǎng)。有研究報(bào)道,腫瘤相關(guān)死亡人數(shù)目前已占到了我國(guó)全年總死亡人數(shù)的25%[1]。肝癌,包括肝細(xì)胞肝癌和肝內(nèi)膽管癌,有著遷延不愈、晚期患者預(yù)后大多不良的特點(diǎn),其發(fā)病率在國(guó)內(nèi)所有的腫瘤性疾病中位列第四,而其死亡率則位列第三位;在世界范圍內(nèi),肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病率和死亡率也位居前列[2]。20世紀(jì)20年代,Otto Warburg首次觀察到腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下,其糖代謝過(guò)程也會(huì)更傾向于糖酵解方向。因此,腫瘤中這種糖代謝重組特點(diǎn)也被稱為“溫伯格效應(yīng)”[3],該特點(diǎn)在2011年被歸納入腫瘤的10大特征[4]。近年來(lái)的研究在不斷解明溫伯格效應(yīng)產(chǎn)生的具體機(jī)制的同時(shí),也發(fā)現(xiàn)了腫瘤中這種代謝特點(diǎn)可能與疾病的預(yù)后、腫瘤的惡性程度或其大小相關(guān)[5];但也有研究者認(rèn)為,在腫瘤組織中,并不是所有的腫瘤細(xì)胞都像研究中已報(bào)道的那樣執(zhí)行糖酵解模式,而是分成了溫伯格型細(xì)胞和氧化磷酸化型細(xì)胞兩類腫瘤細(xì)胞[6]。有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的遷延不愈是由于存在具有自我更新和多向分化能力的腫瘤干細(xì)胞,這類細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的最主要因素[7-8]。迄今為止,很少有研究指明腫瘤干細(xì)胞是否也存在糖代謝上的改變。本研究旨在通過(guò)對(duì)比腫瘤干細(xì)胞與一般腫瘤細(xì)胞的代謝特點(diǎn),探究腫瘤細(xì)胞的干性與其糖代謝特征的關(guān)聯(lián)。

        1 材料和方法

        1.1 試劑和材料

        1.1.1 研究對(duì)象

        人肝腫瘤細(xì)胞系Huh-7、人肝細(xì)胞系LO2均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,人肝腫瘤細(xì)胞系MHCC97H為復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院保存細(xì)胞系。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

        實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)體系中DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12混合培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,無(wú)血清懸浮培養(yǎng)添加細(xì)胞因子B27、bFGF、HGF及EGF也均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、超低黏附6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司,流式細(xì)胞術(shù)分選所用抗體BV421-EpCAM、PE-CD133、APCCD90均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

        RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自QIAGEN公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成,反應(yīng)體系為寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTM,相關(guān)引物序列見表1[9-17],RTFQPCR反應(yīng)條件見表2。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)抗體兔抗人HexokinasesⅡ抗體、兔抗人GLUT1抗體、兔抗人PKM2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,兔抗人LDH-A抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,鼠抗人β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Intech公司,葡萄糖類似物2-NBDG購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司。生成的乳酸含量用美國(guó)強(qiáng)生VITROS 5600全自動(dòng)生化免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

        表1 腫瘤干性標(biāo)志物和糖代謝酶相關(guān)基因名稱、引物序列Tab.1 Cancer stem cell markers and glycolysis-related enzyme genes’names and primer sequences

        表2 RTFQ-PCR反應(yīng)條件Tab.2 Reaction conditions of RTFQ-PCR

        1.2 方法

        1.2.1 干細(xì)胞流式分選和培養(yǎng)

        對(duì)肝癌細(xì)胞系Huh-7、MHCC97H的干細(xì)胞標(biāo)志物(EpCAM、CD90、CD133)進(jìn)行標(biāo)記,用BD FACS AriaⅡ流式細(xì)胞分選儀分選干性標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞,對(duì)其計(jì)數(shù)后進(jìn)行無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含2%生長(zhǎng)因子B27、20 ng/mL的bFGF、10 ng/mL的HGF及20 ng/mL的EGF)懸浮培養(yǎng),干性標(biāo)志物陰性的細(xì)胞作為對(duì)照組細(xì)胞用同樣的方式進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境中,每2天根據(jù)培養(yǎng)情況更換或補(bǔ)充培養(yǎng)基。

        1.2.2 RTFQ-PCR和Western blot檢測(cè)

        培養(yǎng)完成后提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄后運(yùn)用RTFQPCR以β-actin為內(nèi)參,對(duì)成球細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的干性標(biāo)志物、糖代謝酶相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量[9-17]。提取蛋白變性后在10%SDS-PAGE中以β-actin為內(nèi)參,對(duì)糖代謝酶蛋白表達(dá)量進(jìn)行電泳檢測(cè)。

        1.2.3 細(xì)胞葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)

        細(xì)胞分選、計(jì)數(shù)成球培養(yǎng)后,分別取5×104個(gè)Huh-7、MHCC97H的成球和非成球細(xì)胞混合,用低糖型無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓處理后加入濃度為150 μmol/L的2-NBDG溫育,用DAPI染色后在熒光顯微鏡的FITC/DAPI通道下鏡檢拍照,并用BD FACS AriaⅡ流式細(xì)胞分選儀對(duì)其細(xì)胞內(nèi)FITC通道的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算[18-19]。

        1.2.4 細(xì)胞乳酸生成實(shí)驗(yàn)

        細(xì)胞分選、成球培養(yǎng)后,分別取4×103個(gè)Huh-7、MHCC97H的成球和非成球細(xì)胞接種入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上1 mL的高糖型DMEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)4 h后,對(duì)其培養(yǎng)上清液中乳酸的生成量進(jìn)行檢測(cè)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用Microsoft Office Excel 2013、IBM SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行相關(guān)圖像的繪制。RTFQ-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCq法[ΔΔCq=ΔCq(target cell)-ΔCq(control group cell),ΔCq=Cq(target)-Cq(β-actin)]進(jìn)行處理,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 肝腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的成球能力

        采用流式細(xì)胞術(shù)分選干性標(biāo)志物(CD90、CD133、EpCAM)dim區(qū)和pos區(qū)的細(xì)胞(圖1A為分選的huh7干性標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞,圖1B為分選的MHCC97H干性標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞)并進(jìn)行無(wú)血清懸浮培養(yǎng)10 d后,在倒置顯微鏡下觀察可見相比干性標(biāo)志物陰性的細(xì)胞,干性標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞已成明顯的球狀(圖1C)。分別對(duì)成球細(xì)胞和非成球的干性標(biāo)志物進(jìn)行RTFQ-PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示,成球細(xì)胞的干性標(biāo)志物的表達(dá)較非成球細(xì)胞更顯著(圖1D,P<0.05)。這一結(jié)果表明,相比不表達(dá)干性標(biāo)志物的肝腫瘤細(xì)胞,表達(dá)干性標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)環(huán)境中能夠成球,這一培養(yǎng)模式能作為富集腫瘤干細(xì)胞的手段。

        2.2 腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的糖酵解代謝酶表達(dá)

        以人肝細(xì)胞系LO2為對(duì)照、β-actin為內(nèi)參,對(duì)成球、非成球腫瘤細(xì)胞丙酮酸激酶同工酶M2(pyruvate kinase isozyme M2,PKM2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter 1,GLUT-1)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A)、己糖激酶2(hexokinase Ⅱ,HK-Ⅱ)等糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)情況分別通過(guò)RTFQ-PCR和Western blot進(jìn)行了驗(yàn)證(圖2)。GLUT-1、PKM2和LDH-A等糖酵解關(guān)鍵酶在肝腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)較正常肝細(xì)胞均有顯著的升高(圖2A,P<0.05),而其在成球細(xì)胞中的表達(dá)較非成球細(xì)胞則有更進(jìn)一步地升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在蛋白水平上,相比非成球細(xì)胞,成球細(xì)胞LDH-A、PKM2、HK2及GLUT-1的表達(dá)也有顯著的提升。該結(jié)果表明,腫瘤干細(xì)胞的糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)量相比非成球的腫瘤細(xì)胞更高,提示腫瘤干細(xì)胞所含有的糖酵解酶含量更豐富,腫瘤干細(xì)胞的代謝向糖酵解轉(zhuǎn)變的程度更高(圖2B)。

        圖1 干性標(biāo)志物陽(yáng)性的肝腫瘤細(xì)胞具有成球能力Fig.1 HCC cells with positive cancer stem cell markers could shape spheroids

        圖2 成球與非成球細(xì)胞糖酵解酶/蛋白表達(dá)情況圖Fig.2 Comparison of glycolysis enzymes and proteins between spheroid and non-spheroid cells

        2.3 腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的葡萄糖攝取能力

        本實(shí)驗(yàn)中采用了2-NBDG對(duì)成球及非成球細(xì)胞在同一葡萄糖供應(yīng)體系下對(duì)葡萄糖的攝取能力進(jìn)行了對(duì)比。圖3A為MHCC97H細(xì)胞組、Huh-7細(xì)胞組的2-NBDG攝取結(jié)果圖,圖中綠色熒光為被細(xì)胞攝取后的2-NBDG;藍(lán)色熒光為DAPI染色后的細(xì)胞核成分。在熒光顯微鏡下可見,在同一葡萄糖供應(yīng)體系下成球細(xì)胞有著對(duì)葡萄糖明顯更多的攝取,表明腫瘤干細(xì)胞的葡萄糖攝取能力顯著強(qiáng)于非干性腫瘤細(xì)胞。

        將攝取了2-NBDG的成球與非成球Huh-7細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度,結(jié)果顯示,其平均熒光強(qiáng)度也存在著顯著的差異?;疑珵槲磾z取2-NBDG的背景熒光,紫色為攝取2-NBDG后的非成球細(xì)胞,藍(lán)色為攝取2-NBDG后的成球細(xì)胞,成球腫瘤細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯高于非成球的腫瘤細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(成球組平均熒光強(qiáng)度為17 637,非成球組平均熒光強(qiáng)度為12 567,P<0.05),這也說(shuō)明成球細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力明顯高于非成球細(xì)胞(圖3B)。

        2.4 腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的乳酸生成能力

        本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)定量的成球和非成球細(xì)胞在含有等量葡萄糖的等量培養(yǎng)基中產(chǎn)生的乳酸情況進(jìn)行了對(duì)比。在相同條件下,成球腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)后產(chǎn)生并排至細(xì)胞上清液中的糖酵解終產(chǎn)物——乳酸的量較非成球細(xì)胞更多。本研究中成球腫瘤細(xì)胞不僅葡萄糖攝取能力高,成球腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力也明顯強(qiáng)于非成球細(xì)胞(表3)。

        圖3 成球與非成球細(xì)胞葡萄糖攝取能力結(jié)果圖Fig.3 Comparison of glucose uptake ability between spheroid and non-spheroid cells

        表3 成球與非成球細(xì)胞乳酸生成能力對(duì)比Tab.3 Comparison of lactic acid production ability between spheroid and non-spheroid cells

        3 討 論

        近年來(lái),腫瘤的發(fā)病率和死亡率都呈逐年上升的趨勢(shì),在我國(guó),肝癌一直以來(lái)都是威脅人們健康的一個(gè)重大問(wèn)題,2015年因肝癌死亡的患者就達(dá)到了422 100例。雖然目前針對(duì)肝細(xì)胞肝癌的治療手段有外科手術(shù)、介入手術(shù)等,但這類患者很多仍難以逃過(guò)術(shù)后疾病復(fù)發(fā)、腫瘤遷延不愈的問(wèn)題。

        腫瘤干細(xì)胞有著和正常干細(xì)胞一樣的自我更新、多能分化的特點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞的這一特點(diǎn)也被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及抗癌藥物耐藥性的產(chǎn)生有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。為了能發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的存在,近年來(lái)建立了許多富集腫瘤干細(xì)胞的方法,包括陽(yáng)選法、陰選法、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)等。其中,陽(yáng)選法的思路也被用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集中。另外,研究也發(fā)現(xiàn)了許多腫瘤的干性標(biāo)志物,包括CD90、EpCAM、CD133和CD24[9-12]等。而由于腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性,僅運(yùn)用單一的腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物可能產(chǎn)生漏檢的情況。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)是一種較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的富集手段[20],本研究也將陽(yáng)選法和無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法用于肝癌干細(xì)胞的富集中。

        另一方面,腫瘤細(xì)胞的代謝也是近年來(lái)學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。腫瘤細(xì)胞的溫伯格效應(yīng),或稱“有氧糖酵解”現(xiàn)象就是腫瘤代謝重組的一個(gè)重要的特點(diǎn)。眾所周知,腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)需要大量的ATP,而有氧糖酵解相比氧化磷酸化,其產(chǎn)能水平和效率都遠(yuǎn)為低下。目前的研究也發(fā)現(xiàn),為了彌補(bǔ)這種產(chǎn)能效率的不足,腫瘤細(xì)胞往往都傾向于提升其對(duì)葡萄糖的攝取、提升其糖酵解酶的作用以及增加代謝副產(chǎn)物的排泌等,最典型的改變就表現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞糖酵解相關(guān)酶/蛋白的表達(dá)量、功能的提升上,如GLUT-1、HK-Ⅱ、PKM2和LDH-A等。目前的研究中也有學(xué)者證實(shí),腫瘤細(xì)胞“有氧糖酵解”的代謝重組現(xiàn)象也與某些癌基因(如ras、myc等)及相關(guān)信號(hào)通路的激活和(或)抑癌基因[21-22](如p53等)的失活以及腫瘤相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)增加(如HIF-1α等)[23]有關(guān),而這些基因的改變也能影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

        本研究首先根據(jù)先前的研究[9-12,24],根據(jù)CD133、CD90和EpCAM等干性標(biāo)志物的表達(dá)情況對(duì)Huh-7和MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行分選后培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),干性標(biāo)志物高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞能在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的環(huán)境中成球;對(duì)這兩種細(xì)胞的干性標(biāo)志物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本水平的分析表明,成球細(xì)胞的干性標(biāo)志物較非成球細(xì)胞的表達(dá)有著顯著的提升。由此可見,腫瘤干細(xì)胞有著能在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的環(huán)境中成球的特點(diǎn),這一培養(yǎng)條件能作為富集腫瘤干細(xì)胞的手段。

        本研究以永生的人肝細(xì)胞系LO2為對(duì)照,對(duì)成球細(xì)胞和非成球細(xì)胞糖酵解酶的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,除了HK-Ⅱ,相比正常肝細(xì)胞系LO2,肝癌細(xì)胞系Huh-7和MHCC97H的糖酵解酶mRNA表達(dá)更高,而成球細(xì)胞的糖酵解酶mRNA表達(dá)顯著高于非成球細(xì)胞。在蛋白水平上,成球Huh-7細(xì)胞的LDH-A、PKM2、HK-Ⅱ和GLUT-1的表達(dá)均顯著高于非成球Huh-7細(xì)胞,也均高于LO2細(xì)胞;而成球的MHCC97H細(xì)胞也有類似的表現(xiàn)(GLUT-1除外)。這提示我們,相比非成球腫瘤細(xì)胞及正常肝細(xì)胞,成球腫瘤細(xì)胞的糖酵解酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)更豐富。在熒光顯微鏡下對(duì)比成球細(xì)胞與非成球細(xì)胞在同一葡萄糖供應(yīng)體系中對(duì)葡萄糖類似物2-NBDG的攝取可見,成球細(xì)胞攝取的2-NBDG的熒光相比非成球細(xì)胞中更為明亮和豐富,提示成球細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力遠(yuǎn)高于非成球細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn);同時(shí),在相同培養(yǎng)條件下,成球細(xì)胞的乳酸生成量遠(yuǎn)高于非成球細(xì)胞,表明干性表達(dá)的成球細(xì)胞的糖代謝重構(gòu)程度遠(yuǎn)高于非干性的非成球細(xì)胞,腫瘤干細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用能力更強(qiáng),糖酵解通路更活躍,結(jié)果提示腫瘤糖代謝重構(gòu)的程度和腫瘤細(xì)胞的干性表達(dá)存在相關(guān)性。

        綜上所述,本研究結(jié)果表明,無(wú)血清懸浮培養(yǎng)是一種可用來(lái)富集肝腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方式;此外我們也觀察到肝腫瘤干細(xì)胞的糖酵解活躍程度高于非干性的腫瘤細(xì)胞。

        嫩草伊人久久精品少妇av| 久久久久亚洲AV无码专区喷| 国产91在线|亚洲| 久久国产精品免费一区二区三区| 凌辱人妻中文字幕一区| 97色伦综合在线欧美视频| 六月丁香久久| 日韩精品成人一区二区三区久久久 | 一区二区三区四区草逼福利视频| 国产精品人妻一区二区三区四| 天天干成人网| 中文字幕麻豆一区二区| 久久一区二区三区少妇人妻| 精品成在人线av无码免费看| 久久久久无码国产精品不卡 | 亚洲av毛片成人精品| 亚洲av综合色一区二区| 亚洲国产成人av在线观看| www插插插无码免费视频网站| 日本加勒比东京热日韩| 日韩精品极品免费在线视频| 熟女体下毛荫荫黑森林| 97精品依人久久久大香线蕉97| 激情亚洲的在线观看| av中文字幕一区人妻| 亚洲性无码一区二区三区| 亚洲免费观看| 日本激情久久精品人妻热| 伊人情人色综合网站| 亚洲国产精品久久亚洲精品| 亚洲香蕉毛片久久网站老妇人| 成av人片一区二区久久| 性无码专区无码| 亚洲成人免费观看| 久久99久久久精品人妻一区二区| 精品香蕉一区二区三区| 国产成人vr精品a视频| 狠狠亚洲婷婷综合久久久| 精品粉嫩av一区二区三区| 中文日韩亚洲欧美制服| 国产目拍亚洲精品一区二区|