楊 雪，吳英理，許 潔，仝 佳，井 博，王瑩瑩，朱 琦

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院血液內(nèi)科，上海 200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院感染科，上海 200011；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海 200025

結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤［extranodal natural killer（NK）/T-cell lymphoma，ENKTCL］是起源于自然殺傷細胞（少部分可能是成熟T淋巴細胞）的高度侵襲性惡性淋巴瘤。早期局限性ENKTCL患者采用含有左旋門冬酰胺酶化療序貫局部放療可以取得良好療效，但進展期患者通常在治療過程中發(fā)生耐藥而成為復(fù)發(fā)/難治性病例。近年來，隨著造血干細胞移植以及程序性死亡受體-1（programmed death protein-1，PD-1）抑制劑等細胞免疫療法成功應(yīng)用于復(fù)發(fā)/難治性ENKTCL治療，這些患者的緩解率和無病生存率較以往有所提高，然而仍有相當一部分進展期和復(fù)發(fā)/難治性患者在挽救治療后復(fù)發(fā)并對多種藥物產(chǎn)生耐藥［1］。因此，尋找ENKTCL新型治療藥物有其必要性和重要臨床意義。已有研究顯示，阿的平（金雞納樹皮中提取的小分子化合物）可以通過調(diào)變細胞內(nèi)多條信號通路誘導(dǎo)包括T淋巴細胞白血病細胞在內(nèi)的多種血液腫瘤細胞增殖阻滯和凋亡［2-5］，但有關(guān)其對ENKTCL細胞生物學(xué)效應(yīng)研究仍鮮有報道。有鑒于此，我們以ENKTCL細胞株SNK6和NK92細胞為模型，探究阿的平對ENKTCL細胞的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

阿的平購自日本東京化成工業(yè)株式會社，純度為98%，溶于無菌雙蒸水中，配制為50 mmol/L存儲液，置于-20 ℃儲存，待使用時稀釋至所需濃度。AIM-V培養(yǎng)液、雙抗（青霉素/鏈霉素）溶液、0.4%臺盼藍染液購自美國Gibco公司，人AB型血清購自美國GEMINI公司，瑞氏吉姆薩染料購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS：1×）購自江蘇凱基生物有限公司，白細胞介素-2購自上海近岸科技有限公司，Annexin-Ⅴ/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，JC-1試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，ECL試劑盒購自美國Amersham Pharmacia GE公司，BCA試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，p-P70抗體購自美國Proteintech公司，LC3B抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與細胞形態(tài)學(xué)觀察

人ENKTCL細胞系SNK6和NK92細胞分別由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院血液內(nèi)科和上海血液學(xué)研究所提供，將2×105個/mL SNK6和NK92細胞接種于含10%人AB型血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和300 U/mL白細胞介素-2的AIM-V培養(yǎng)液中，常規(guī)條件下培養(yǎng)（37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、95%濕度）24 h后抽取部分細胞進行細胞離心涂片儀涂片，瑞氏吉姆薩染色，光鏡下觀察其細胞形態(tài)，并以Image-Pro Plus軟件拍攝圖像。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的SNK6和NK92細胞，按2×104個/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL。實驗組用5 μmol/L阿的平處理細胞，同時設(shè)置溶劑對照組和空白對照組，每組3個復(fù)孔。置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、95%濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀振蕩，以空白對照孔調(diào)零，測450 nm處各孔吸光度（D）值。按公式：細胞增殖抑制率（%）=（1-D實驗組/D對照組）×100%進行計算。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期、凋亡率、線粒體跨膜電位和活性氧

1.4.1 細胞周期檢測

分別收集實驗組及對照組的SNK6和NK92細胞，PBS洗滌2次后加入3 mL無水乙醇，-20 ℃固定過夜；加入PBS 10 mL混勻，2 500 r/min離心5 min，離心半徑為8.5 cm，洗滌2次，分別加入100 mg/mL RNase 37 ℃溫育30 min；采用100 μg/mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后行流式細胞術(shù)檢測。所有數(shù)據(jù)使用Beckman Coulter公司的Cytoflex LX軟件收集、存儲和軟件分析。

1.4.2 細胞凋亡率檢測

根據(jù)AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒說明，將不同處理組細胞采用PBS洗滌后加入1 mL結(jié)合緩沖液，漂洗細胞1次棄上清液。依次加入100 μL結(jié)合緩沖液及2.5 μL AnnexinV，重懸混勻，避光37 ℃溫育15 min，再加入2 μL PI，避光37 ℃溫育3 min；每管加入結(jié)合緩沖液400 μL，1 h內(nèi)進行流式細胞術(shù)檢測。

1.4.3 線粒體跨膜電位（ΔΨm）檢測

當細胞內(nèi)線粒體ΔΨm正常時，熒光探針JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，發(fā)出強烈紅色熒光；當線粒體ΔΨm下降或喪失后，JC-1以單體形式存在于細胞質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光。因此，線粒體ΔΨm可以通過紅/綠熒光強度比值來衡量。將實驗組及對照組SNK6和NK92細胞以配制好的JC-1緩沖液重懸，按照JC-1試劑盒說明操作，分別加入10 μg/mL JC-1工作液，并于37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中溫育30 min，2 500 r/min離心5 min，離心半徑8.5 cm，棄上清液，PBS洗滌1次，采用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)紅綠熒光比值。

1.4.4 細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測

二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）可以自由透過活細胞膜進入細胞內(nèi)，并被細胞內(nèi)超氧陰離子型ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光，因此，細胞內(nèi)ROS水平可以通過測定細胞內(nèi)紅色熒光強度來衡量。將實驗組及對照組SNK6和NK92細胞以預(yù)冷PBS洗兩遍，棄上清液，200 μL PBS重懸細胞沉淀，加入20 ng/mL DHE 37 ℃溫育1 h，2 500 r/min水平離心5 min，PBS洗滌2次，采用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)紅色熒光強度。

1.5 蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測細胞自噬相關(guān)蛋白表達

在PBS洗滌后的各組SNK6和NK92細胞中加入細胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒定量后，取各組等量總蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜；膜經(jīng)室溫5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應(yīng)一抗（包括磷酸化P70和LC3B），4 ℃水平搖床過夜；經(jīng)含0.1%Tween-20的PBS充分洗滌后與相應(yīng)稀釋度的兔二抗室溫反應(yīng)1 h，采用ECL試劑盒顯影掃描保存。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 阿的平對SNK6和NK92細胞生長的影響

ENKTCL 系SNK 6 和NK 92 細胞經(jīng)5 μmol/L阿的平處理24 和48 h后，實驗組SNK6和NK92細胞生長抑制率［SNK6細胞為（40.18±4.72）%和（47.08±2.19）%，NK92細胞為（28.29±0.92）%和（30.46±7.95）%］，明顯高于對照組［SNK6細胞為（25.29±1.47）%和（11.85±1.89）%，NK92細胞為（18.95±3.44）%和（10.08±2.01）%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 阿的平對 SNK6和NK92 細胞生長的影響Tab.1 Effect of quinacrine on the proliferation and survival of SNK6 and NK92 cells

2.2 阿的平對SNK6和NK92細胞凋亡率和線粒體ΔΨm的影響

AnnexinV/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡率的結(jié)果顯示，SNK6和NK92細胞經(jīng)5 μmol/L 阿的平處理24 h后，實驗組SNK6和NK92細胞凋亡率分別為（86.45±6.54）%和（76.50±10.80）%；明顯高于對照組的（3.3±3.24）%和（2.64±1.67）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。形態(tài)學(xué)觀察顯示，阿的平處理組細胞均出現(xiàn)細胞體積縮小、細胞內(nèi)大量空泡、細胞核濃縮、細胞核固縮和碎裂等典型凋亡形態(tài)學(xué)改變（圖1）。此外，阿的平處理24 h后SNK6和NK92細胞的紅/綠熒光值分別為（313.77±144.34）和（47.98±4.08），對照組SNK6和NK92細胞紅/綠熒光值分別為（57.96±23.47）和（72.66±9.02），與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

圖1 阿的平處理SNK6和NK92細胞24 h后形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Effect of quinacrine on the morphologic changes of SNK6 and NK92 cells after 24 h

2.3 阿的平對SNK6和NK92細胞周期的影響

SNK6和NK92細胞經(jīng)5 μmol/L 阿的平處理12 h后，細胞周期DNA合成期（S期）比例分別達到（46.08±2.48）% 和（58.08±0.86）%，明顯高于對照組（32.93±1.51）%和（47.73±1.29）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。相應(yīng)地，實驗組細胞靜止期（G0期）/DNA合成前期（G1期）比例顯著低于對照組［實驗組：（25.10±0.33）% 和（27.57±0.21）%；對照組：（45.43±2.00）%和（38.30±0.71）%；P＜0.05，表2］，但DNA合成后期（G2期）/分裂期（M期）比例實驗組與對照組比較［實驗組：（28.83±2.25）% 和（14.36±0.65）%；對照組：（21.63±2.92）%和（13.98±0.28）%］，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。這提示SNK6和NK92細胞經(jīng)阿的平處理后發(fā)生細胞周期S期阻滯。

表2 阿的平對SNK6和NK92 細胞周期的影響Tab.2 Effect of quinacrine on the cell cycle distribution of SNK6 and NK92 cells

2.4 阿的平對SNK6和NK92細胞內(nèi)ROS水平的影響

SNK6細胞經(jīng)5 μmol/L阿的平單獨或聯(lián)合氧自由基清除劑N乙酰半胱氨酸（NAC）處理24 h后，阿的平單藥組細胞內(nèi)紅色熒光強度明顯高于對照組和聯(lián)合用藥組，說明SNK6細胞經(jīng)阿的平處理后細胞內(nèi)ROS水平上升，而NK92細胞經(jīng)阿的平單藥處理后細胞內(nèi)紅色熒光強度與對照組和聯(lián)合用藥組比較無明顯差異，提示阿的平對NK92細胞內(nèi)ROS水平無顯著影響（圖2）。

圖2 阿的平對SNK6和NK92細胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effect of quinacrine on the level of ROS in SNK6 and NK92 cells

2.5 阿的平對SNK6和NK92細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達的影響

用5 μmol/L阿的平處理SNK6和NK92細胞24 h后，Western blot檢測細胞內(nèi)磷酸化P70（phosphorylated P70，p-P70）和LC3B蛋白表達情況，其中p-P70是mTOR通路主要的靶蛋白，而LC3B是細胞自噬標志物。結(jié)果顯示，阿的平可以使SNK6和NK92細胞內(nèi)p-P70蛋白表達水平顯著下降，而LC3B蛋白表達明顯上調(diào)（圖3）。

圖3 阿的平對SNK6和NK92細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達的影響Fig.3 Effect of quinacrine on the expression of autophagy modulator in SNK6 and NK92 cells

3 討 論

近二十年，ENKTCL基礎(chǔ)和臨床研究取得了長足進步，但淋巴瘤細胞克隆演變、細胞內(nèi)增殖相關(guān)基因變化以及細胞表觀遺傳學(xué)改變等都可能導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，并對現(xiàn)有治療方案產(chǎn)生耐藥而成為復(fù)發(fā)/難治性病例。除了深入優(yōu)化現(xiàn)有治療藥物組合外，積極探究新型有效藥物和治療模式是改善復(fù)發(fā)/難治性ENKTCL臨床療效和預(yù)后的主要途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)抗寄生蟲小分子化合物阿的平不僅可以誘導(dǎo)多種實體腫瘤（包括肝細胞癌、婦科腫瘤、前列腺癌和結(jié)腸癌等）細胞凋亡［6-10］，還可以通過調(diào)變細胞內(nèi)多個信號調(diào)控分子誘導(dǎo)T淋巴細胞白血病細胞增殖阻滯和凋亡［2-3］，鑒于阿的平對T淋巴細胞生物學(xué)效應(yīng)以及NK細胞與T淋巴細胞起源相似性，本研究采用阿的平處理ENKTCL細胞株SNK6和NK92細胞，觀察阿的平對ENKTCL細胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，阿的平可以抑制SNK6和NK92細胞生長，處理24 h后細胞形態(tài)呈現(xiàn)細胞核固縮和凋亡小體等典型凋亡表現(xiàn)，流式細胞術(shù)AnnexinⅤ/PI雙染法檢測結(jié)果也進一步顯示，用藥組SNK6和NK92細胞凋亡率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示，阿的平能夠誘導(dǎo)ENKTCL細胞增殖阻滯和凋亡。細胞增殖和凋亡是細胞生命活動中相對立的兩個方面。本實驗發(fā)現(xiàn)，阿的平將絕大多數(shù)SNK6和NK92細胞阻滯在S期，說明阿的平可以干擾細胞內(nèi)DNA合成進而可能使其發(fā)生損傷，一旦細胞內(nèi)損傷DNA無法修復(fù)無疑將有利于細胞凋亡，但阿的平引起細胞周期變化進而誘發(fā)凋亡的具體機制，還需我們進一步研究。此外，經(jīng)典細胞凋亡主要包括線粒體途徑和死亡受體途徑，其中線粒體途徑與細胞內(nèi)線粒體跨膜電位變化密切相關(guān)，本實驗發(fā)現(xiàn)，阿的平對SNK6和NK92細胞內(nèi)線粒體跨膜電位無顯著影響，提示阿的平誘導(dǎo)細胞凋亡可能是通過細胞內(nèi)非線粒體凋亡途徑。

許多研究顯示，ROS即由氧直接或間接轉(zhuǎn)變的氧自由基及其擬似物與細胞凋亡密切相關(guān)［3，11-12］。本實驗發(fā)現(xiàn)，阿的平可以明顯提高SNK6細胞內(nèi)ROS水平，但NK92細胞無相似變化，提示阿的平誘發(fā)細胞內(nèi)ROS含量增加可能是其介導(dǎo)ENKTCL細胞凋亡關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但非唯一或必要途徑。另一方面，自噬作為另一種程序性細胞死亡現(xiàn)象，是細胞通過降解細胞質(zhì)和細胞器實行"自我消化"的細胞應(yīng)急機制。近來研究發(fā)現(xiàn)，自噬與凋亡可通過內(nèi)在分子調(diào)控機制與凋亡相互協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化，共同促進細胞死亡，自噬主要受mTOR通路負向調(diào)控，而p-P70是該通路關(guān)鍵靶蛋白［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，阿的平不僅可以下調(diào)SNK6和NK92細胞內(nèi)p-P70的表達，而且促使自噬標志物L(fēng)C3B蛋白表達明顯上調(diào)，這個結(jié)果提示，阿的平可能通過抑制ENKTCL細胞內(nèi)mTOR通路進而促進細胞自噬，自噬可能與細胞凋亡密切相關(guān)。必須指出的是，上述結(jié)果只是說明阿的平可以誘導(dǎo)ENKTCL細胞自噬，但自噬如何通過內(nèi)在分子調(diào)控機制與凋亡相互協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化仍需進一步研究。

綜上所述，阿的平可能通過觸發(fā)細胞內(nèi)ROS水平升高以及抑制mTOR信號通路進而激活細胞自噬促使ENKTCL細胞增殖阻滯和凋亡，考慮到阿的平與現(xiàn)有治療藥物無交叉耐藥性，因此，阿的平可能有更好的臨床療效，未來可望被納入ENKTCL的新型治療方案。