郭兆來，孫旭東，楊永平，徐慧妮

(1.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500;2.中國科學院 昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

LBD(Lateral organ boundaries domain)是一類植物所特有的轉錄因子，具有保守的LOB(Lateral organ boundary)結構域。LOB結構域的特征是有具DNA結合活性的CX2CX6CX3C鋅指結構域和Gly-Ala-Ser(GAS)域及具蛋白結合活性的LX6LX3LX6L亮氨酸拉鏈結構域組成[1]。LBD蛋白家族可以分為2個亞家族：Class Ⅰ和Class Ⅱ[2-3]。Class Ⅰ主要參與了植物側生器官的發(fā)育和生長素信號的級聯傳遞[4-6]。而Class Ⅱ主要參與了花青素的合成和氮代謝[7]。

AtLBD15是擬南芥LBD家族的一個成員，在擬南芥葉柄細胞脫分化研究中發(fā)現，AtLBD15可能參與了擬南芥葉柄細胞的脫分化過程，進一步研究發(fā)現AtLBD15表達可能受細胞分裂素的調控[12]。并且LBD15參與調控維管組織分化的調控[13]。Mangeon等[14]研究發(fā)現，LBD基因家族功能具有多樣性，其多樣性可能與啟動子區(qū)調控域和編碼區(qū)功能域的不同相關，調控區(qū)域和功能域的多樣性能夠導致重復基因的亞功能化或者新功能[15-16]。本研究通過酵母雙雜技術篩選到一批與LBD15互作的調控蛋白，為進一步解析擬南芥LBD15的分子機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用擬南芥為哥倫比亞(Columbia Col-0)，種植于云南省昆明市中國科學院昆明植物研究所，酵母菌株Y2HGold、Y187，大腸桿菌(Escherichiacoli)都是云南省昆明市中國科學院昆明植物研究所種質庫保藏的；酵母雙雜交載體的質粒為pDEST-GADT7(pGADT7，AD)、pDEST-GBKT7(pGBKT7，BD)，質粒購置自ABRC。

1.2 擬南芥RNA提取及反轉錄

利用EastepTM Universal RNA Extraction Kit (Promega，中國上海)試劑盒提取擬南芥總RNA，用ND-1000分光光度計檢測RNA濃度和質量。利用GoScriptTM?Reverse Transcription System試劑盒以提取的總RNA為模板反轉錄合成cDNA。以反轉錄的cDNA為模板用LBD15基因特異引物(ENTR-L15F：caccATGTCAAGAGAAAGGGAGAG；ENTR-L15R：ACCGAAGTAGTTGTTCTCAC)擴增得到LBD15的基因序列。利用Gateway技術將LBD15重組到質粒pGADT7、pGBKT7，PCR檢測陽性克隆，陽性克隆送碩擎測序驗證。

1.3 酵母轉化、重組質粒細胞毒性和自激活檢測

將構建好的BD-LBD15重組質粒轉入到用LiAC法制備的Y2HGold酵母菌株的感受態(tài)細胞中，用SD/-T選擇性平板進行篩選，將篩選到的單菌落在SD/-T液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且用作酵母雜交的種子液。

1.4 通過酵母cDNA文庫篩選結合蛋白

將上述轉化到酵母Y2HGold菌株中的重組質粒BD-LBD15，通過選擇性平板(SD/-T)篩選后，在28 ℃搖床中培養(yǎng)到OD260=0.8，然后將其與含有cDNA文庫的酵母Y187菌株混合培養(yǎng)24 h，將混合培養(yǎng)后的酵母細胞離心，棄多余的上清，剩下100 μL重懸沉淀后，涂到TDO(SD/-Trp/-Leu/-Ade)的平板上，放入28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d取出，在超凈臺里用滅過菌的槍頭將平板上的菌落轉移到QDO(SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His)平板上，菌落的編號不變， 28 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，挑選QDO平板上的菌落，28 ℃搖床上進行培養(yǎng)，用酵母質粒提取試劑盒提取質粒，然后轉化大腸桿菌，在37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選單菌落按編號送到公司測序，對測序后的結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 含LBD15基因的pGBKT7載體的重組

RT-PCR克隆LBD15基因獲得大小為675 bp的片段(圖1-A),與預期條帶相符；用Gateway技術將LBD15重組到質粒pGBKT7后轉化大腸桿菌。挑選單菌落進行PCR鑒定有帶，提取PCR鑒定有帶的重組表達載體的質粒然后進行雙酶切驗證(圖1-B)，陽性克隆的菌送到碩擎測序公司進行測序鑒定。

2.2 重組質粒pGBKT7-LBD15的自激活檢測

將構建得到的BD-LBD15和AD質粒轉入到酵母Y2HGold菌株中，在選擇性的二缺平板(SD/-Leu/-Trp)上進行篩選，并且將長出來的酵母菌落點滴到四缺板上(SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His)，同時共轉pGADT7(AD)和BD到Y2HGold菌株中，作為負對照，放入28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d后觀察結果，試驗組和負對照沒有菌落長出，說明重組質粒BD-LBD15沒有自激活現象，即LBD15蛋白在酵母菌株Y2H中沒有自激活的現象，適合用作互作蛋白文庫的篩選(圖2)。

A.LBD15基因PCR擴增；B.酵母表達載體pGBKT7-LBD15雙酶切鑒定；M1.DNA分子量標準500～2 000 bp; M2.DNA分子質量標準500～2 000 bp。

A.PCR amplification ofLBD15gene; B.Identification of yeast expression vector pGKT7-LBD15by double enzyme digestion; M1. DNA Marker DL2000; M2.DNA Marker DL2000.

圖1 含LBD15基因的酵母表達載體構建
Fig.1 Construction of yeast expression vectorcontainingLBD15gene

圖2 pGBKT7-LBD15自激活檢測Fig.2 Identification of pGBKT7-LBD15 for auto-activation

2.3 互作蛋白的篩選與分離

將共轉化酵母菌株Y2H感受態(tài)細胞中的BD-LBD15質粒和擬南芥cDNA文庫均勻的涂布于DDO/X/A的固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；挑選陽性的單克隆進一步接種到QDO/X/A固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。將候選的陽性單克隆轉接到DDO/X固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后篩選分離出藍色陽性單克隆(圖3)。

圖3 候選蛋白在DDO/X固體培養(yǎng)基中的篩選Fig.3 Screening of candidate proteins in DDO/X solid medium

2.4 LBD15 cDNA文庫的篩選結果

把在TDO板上得到的酵母菌落，在轉移到新的TDO平板上保存并給予唯一編號，然后挑選單菌落，搖菌提質粒，再轉化大腸桿菌，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑選單菌落，搖菌后送到公司進行測序。

在本次篩庫試驗中，146個樣送測序有107個測出序列，通過NCBI Blast分析，其中有96個獲得了基因號，占總數的87.9%。根據基因號進行分類，得到了48個蛋白。然后把基因號通過網站TAIR(www.arabidopsis.org/index.jsp)查找其蛋白序列，通過http://cello.life.nctu.edu.tw/分析其亞細胞定位。每個蛋白在篩選文庫中重復的次數以及功能的描述如表1所示。在篩選到的這48個蛋白中有59%的蛋白都有重復。

表1 LBD15結合蛋白及功能分析Tab.1 The functional analysis of LBD15 binding proteins

利用Blast2GO對候選的48個基因進行了Gene Ontology(GO)注釋(圖4)，結果表明，AtLBD15候選互作蛋白參與了14個生物過程，包括細胞過程、代謝過程、刺激響應、生物過程的調控、單組織和多組織過程及發(fā)育進程調控等。

圖4 AtLBD15候選互作蛋白Go Ontology注釋Fig.4 Go Ontology annotation of AtLBD15 candidate interaction proteins

2.5 互作蛋白的分離和回復驗證

將BD-LBD15誘餌質粒和篩選出的互作蛋白的質粒共轉化酵母感受態(tài)細胞，在SD/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型平板上培養(yǎng)，挑選單菌落于1 mL YPDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，吸取1 μL培養(yǎng)渾濁的菌液點至SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His營養(yǎng)缺陷型平板上培養(yǎng)，結果發(fā)現，AP19蛋白及其他一些蛋白的菌落能夠在營養(yǎng)缺陷型的平板上正常生長(圖5)，初步證實，AP19等候選蛋白與LBD15蛋白在酵母細胞中互作。

圖5 酵母雙雜交回復驗證Fig.5 Confirmation of positive interaction by yeast two-hybrid

3 討論

LBD是植物特有的一個轉錄因子家族，在植物生長發(fā)育進程中起著重要的作用。擬南芥基因組中存在42個LBD基因，分為2個亞家族，亞家族Ⅰ比亞家族Ⅱ多了一個卷曲螺旋結構，這一結構可能在蛋白互作中起作用[2]。LBD調控了大量的生長發(fā)育和代謝進程，像葉片發(fā)育、花發(fā)育、胚形成、側根形成及氮和花青素代謝[17-18]。最近的研究發(fā)現，LBD還參與調控了花粉發(fā)育、植物再生、感病性、光形態(tài)建成、次生生長及葉柄發(fā)育[1, 19]。由植物激素誘導植物再生過程的第一步便是愈傷組織的形成, 該過程與側根發(fā)育過程極其相似[20]。

前期工作發(fā)現，LBD15參與了植物再生、莖頂端分生組織調控及次生細胞壁的形成[12, 21-22]。最近又有研究組發(fā)現，LBD15能夠直接結合到VND7啟動子上激活其表達，進而促進導管的形成[23]。利用LBD5篩選酵母文庫，獲得了48個互作的蛋白，這些蛋白參與了多個調控網絡，涉及多個方面的功能，如細胞過程、代謝過程、刺激響應、生物過程的調控和發(fā)育過程等，證實了LBD功能多樣性的作用機制。在篩選的48個互作蛋白種有1個Expansin-LikeA1(EXPLA)蛋白，但是AtLBD15和EXPLA作用機理還不了解。LBD18通過結合到EXP14和EXP17啟動子上激活其表達，進而參與到生長素調控的側根原基起始過程中[9]。而LBD15與EXPLA發(fā)生互作可能與莖頂端分生細胞伸展生長有關。二者之間的互作關系的機理研究對LBD15調控莖頂端分生組織發(fā)育的調控具有一定的意義。維管形成層細胞的表面受體是PXY(Phloem intercalated withxylem), 其通過與亮氨酸的結合作用來介導維管組織的形成。近期有文章研究發(fā)現, PXY同WOX14、LBD4及TMO6(Target of monopteros 6)形成了一個復雜的轉錄調控網絡, 協(xié)同調控維管組織的形成過程[24-25]。

近年來，泛素化過程受到越來越廣泛的關注，其是植物蛋白最常見的修飾方式之一，在細胞生命活動的許多進程中發(fā)揮著重要的作用。泛素化的蛋白質會被蛋白酶體(Proteasome)識別進而被降解。3種泛素酶即：活化酶E1(Ubiquitin activating enzyme)、結合酶E2(Ubiquitin conjugating enzyme)和連接酶E3(Ubiquuitin-protein ligase)共同介導了泛素化這一過程。本試驗篩到1個與AtLBD15互作的泛素結合酶E2-UBC6。推測AtLBD15和UBC6互作可能參與了刺激響應及免疫反應等。

LBD 家族蛋白在高等植物中分布廣泛，在高等植物的生長發(fā)育過程中起著十分重要的作用，然而其功能的分子機制并不清楚。后續(xù)工作將主要獲得擬南芥LBD15互作蛋白的遺傳材料，利用遺傳學和分子生物學深入研究LBD15蛋白的功能，以期更好地闡明其工作機理。