趙永才， 黃 濤

(1. 上海體育學(xué)院研究生部， 上海 200438；2. 上海交通大學(xué)體育系， 上海 200240)

自噬是胞漿中功能紊亂蛋白、細(xì)胞器等成分被雙膜特征自噬體識(shí)別并包裹，在一系列信號(hào)調(diào)節(jié)下與溶酶體結(jié)合，最終被溶酶體降解，降解成分被循環(huán)利用的過程[1]。自噬在各類應(yīng)激條件下，如營養(yǎng)缺乏下能被加速，提高物質(zhì)的循環(huán)利用，這在維持細(xì)胞活力和組織器官生理功能中起關(guān)鍵作用。早期認(rèn)為自噬是非選擇性降解過程，而現(xiàn)在認(rèn)為自噬也可在特異分子調(diào)控下，選擇性降解特定細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等[2]。其中，線粒體通過自噬途徑實(shí)現(xiàn)特異性降解的過程稱之為線粒體自噬，近年來得到深入研究。線粒體自噬指細(xì)胞選擇性將功能損傷線粒體進(jìn)行選擇性識(shí)別，依賴溶酶體將其進(jìn)行降解，實(shí)現(xiàn)線粒體成分的循環(huán)利用，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[3]。

細(xì)胞線粒體自噬與非選擇性自噬在信號(hào)調(diào)節(jié)上有共享通路，但線粒體自噬也有自身特異性調(diào)節(jié)通路，如Pink1/Parkin 信號(hào)參與膜電位下降線粒體的清除[4]。目前發(fā)現(xiàn)線粒體自噬也可由線粒體膜定位受體介導(dǎo)發(fā)生，例如Bnip3和Bnip3L(Nix)擁有高度序列同源性，作為線粒體自噬受體蛋白, 定位于線粒體外模，通過自身LIR區(qū)域與自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白輕鏈-3 (LC3) 結(jié)合，促進(jìn)線粒體被自噬體包裹，誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[5]。營養(yǎng)限制能增強(qiáng)各類組織細(xì)胞自噬的發(fā)生[6]；各類運(yùn)動(dòng)也能促進(jìn)骨骼肌自噬的發(fā)生[7]。但是運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌線粒體自噬的影響研究相對(duì)較少，運(yùn)動(dòng)和飲食限制對(duì)骨骼肌線粒體自噬有何影響還不知曉，兩種因素干預(yù)是否能產(chǎn)生更強(qiáng)線粒體自噬信號(hào)，還不知道。本研究關(guān)注線粒體自噬受體信號(hào)途徑，考察運(yùn)動(dòng)和飲食限制對(duì)小鼠骨骼肌Bnip3/Nix的影響，為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及干預(yù)方法

C57BL/6雄性小鼠(8周)32只，按體重隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(C組)、飲食限制組(D組)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(E組)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+飲食限制組(DE組)，8只/組。C組小鼠不做任何干預(yù)；D組小鼠限制飲食，每天投放量為C組消耗量的60%；E組進(jìn)行10周游泳運(yùn)動(dòng)，1次/天，5天/周，第一周每次20 min，之后每周訓(xùn)練時(shí)間增加10 min，第8～10周維持在每次90 min；DE組同時(shí)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)和飲食干預(yù)，方案與E組和D組相同。訓(xùn)練前和訓(xùn)練干預(yù)結(jié)束后稱量體重，訓(xùn)練結(jié)束1 d后，麻醉處死提取腓腸肌，液氮速凍超低溫保存。

1.2 Western blot檢測(cè)蛋白

稱取30 mg腓腸肌組織，使用裂解液400 μl(碧云天公司提供)勻漿裂解，低溫離心機(jī)12 000 g 離心10 min，獲取總蛋白上清液。蛋白上樣后進(jìn)行電泳(濃縮膠80 v，分離膠110 v恒壓)(Bio-Rad Mini-Protean電泳槽)，然后將分離膠蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，洗滌后脫脂牛奶37℃封閉2 h。一抗孵育過夜， Bnip3、Nix一抗(Boster Biological Technology)稀釋濃度均為1∶600，GAPDH抗體(碧云天公司提供)稀釋濃度為1∶1 000。洗滌后加二抗(1∶1 000，碧云天公司提供)，洗滌后加ECL發(fā)光液(碧云天公司提供)，凝膠成像系統(tǒng)獲得目的蛋白灰度，GAPDH作為內(nèi)參對(duì)目的蛋白表達(dá)進(jìn)行校正。C組均值轉(zhuǎn)化為1，觀察其它組的相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及飲食限制前后小鼠體重變化

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后，只有C組體重增長具有顯著性差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)后，D、E及DE組體重均顯著小于C組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)前后各組體重增長量也呈現(xiàn)類似結(jié)果，D、E及DE組體重增加水平均顯著小于C組(P<0.01，表1)。

GroupBefore intervention(g)After intervention(g)Change of weight(g)C21.65±0.4630.18±1.28#8.53±1.59D21.58±0.9522.98±0.79??1.40±1.11??E22.02±1.0426.88±1.56??4.86±1.70??DE21.64±1.1522.81±1.52??1.18±1.42??

C: Control group; D: Dietary restriction group; E: Exercise training group; DE: Dietary restriction and exercise training group

**P<0.01vsC group；#P<0.05vsbefore intervention

2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及飲食限制對(duì)小鼠骨骼肌Bnip3/Nix信號(hào)的影響

與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)和飲食限制均不同幅度提高小鼠腓腸肌Bnip3和Nix蛋白表達(dá)。D組、E組及DE組干預(yù)模式均提高Bnip3蛋白表達(dá)，增長幅度分別為13%、7%及17%，且均無顯著性差異(P>0.05)。Nix呈現(xiàn)類似表現(xiàn)，相比C組，D組、E組及DE組分別增長了10%、14%及25%，僅DE組Nix表達(dá)顯著高于C組(P<0.05)，具有顯著性差異(圖1)。

Fig.1The expressions of Bnip3 (A) and Nix (B) after exercise training and dietary restriction(n=8)

3 討論

骨骼肌是瘦體重的主要組成成分，本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和飲食限制均可單獨(dú)延緩體重的增長，而且飲食限制加運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)體重增長影響更顯著，其增長幅度最小，提示本次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和飲食限制對(duì)小鼠體重增長的抑制具有疊加效應(yīng)，在飲食限制的基礎(chǔ)上，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能更有效控制體重。骨骼肌線粒體是能量合成“工廠”，肌細(xì)胞線粒體自噬的應(yīng)激變化和適應(yīng)調(diào)節(jié)對(duì)骨骼肌生理功能的維持起重要作用，線粒體自噬配合線粒體合成共同維護(hù)骨骼肌線粒體的質(zhì)量[8]。敲除肌細(xì)胞自噬相關(guān)基因，一次性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的骨骼肌細(xì)胞線粒體自噬被抑制，同時(shí)糖酵解更易被動(dòng)員，有氧能力降低[9]，提示線粒體自噬在骨骼肌能量代謝適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Bnip3、Nix定位于線粒體外模，可直接通過其LIR結(jié)構(gòu)與自噬體LC3進(jìn)行結(jié)合，誘導(dǎo)自噬體包裹損傷線粒體，促進(jìn)自噬發(fā)生[10]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨骼肌Bnip3/Nix途徑研究較少，本文予以關(guān)注。

本次研究發(fā)現(xiàn)飲食和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均可提高Bnip3、Nix蛋白表達(dá)，但Bnip3對(duì)三種干預(yù)方法的敏感度相對(duì)不如Nix，三種干預(yù)模式均提高Bnip3表達(dá)，但均無顯著性；只有飲食限制加運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的復(fù)合干預(yù)模式能顯著提高Nix的表達(dá)，提示運(yùn)動(dòng)和飲食干預(yù)促進(jìn)Nix表達(dá)可能對(duì)線粒體自噬的發(fā)生起到促進(jìn)作用。前期有研究發(fā)現(xiàn)4周主動(dòng)轉(zhuǎn)輪訓(xùn)練可以有效提高小鼠跖肌Bnip3表達(dá)，但有氧代謝為主的比目魚肌Bnip3表達(dá)卻無顯著變化[11]，認(rèn)為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)無氧酵解為特征的肌肉Bnip3影響更顯著。但本研究選取的無氧酵解為主的腓腸肌卻沒有呈現(xiàn)這種表現(xiàn)，訓(xùn)練周期和運(yùn)動(dòng)方式的差異可能是研究矛盾的原因。有研究發(fā)現(xiàn)70%最大攝氧量強(qiáng)度蹬車2 h能顯著提高人體骨骼肌Bnip3、Nix 蛋白表達(dá)[12]。提示Bnip3/Nix信號(hào)對(duì)一次性運(yùn)動(dòng)可能更敏感。Bnip3/Nix信號(hào)對(duì)低氧比較敏感，可能一次性運(yùn)動(dòng)能更易產(chǎn)生缺氧刺激，長期訓(xùn)練骨骼肌存在適應(yīng)過程，對(duì)缺氧存在耐受，可能導(dǎo)致一次運(yùn)動(dòng)和長期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)Bnip3/Nix信號(hào)影響不同。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練加飲食限制能有效促進(jìn)Nix蛋白表達(dá)，有利于線粒體自噬啟動(dòng)。其它線粒體調(diào)節(jié)途徑，如運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)Pink1/Parkin、Fundc1有何種影響，還有待繼續(xù)研究。