趙永才， 黃 濤

(1. 上海體育學院研究生部， 上海 200438；2. 上海交通大學體育系， 上海 200240)

自噬是胞漿中功能紊亂蛋白、細胞器等成分被雙膜特征自噬體識別并包裹，在一系列信號調(diào)節(jié)下與溶酶體結(jié)合，最終被溶酶體降解，降解成分被循環(huán)利用的過程[1]。自噬在各類應(yīng)激條件下，如營養(yǎng)缺乏下能被加速，提高物質(zhì)的循環(huán)利用，這在維持細胞活力和組織器官生理功能中起關(guān)鍵作用。早期認為自噬是非選擇性降解過程，而現(xiàn)在認為自噬也可在特異分子調(diào)控下，選擇性降解特定細胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等[2]。其中，線粒體通過自噬途徑實現(xiàn)特異性降解的過程稱之為線粒體自噬，近年來得到深入研究。線粒體自噬指細胞選擇性將功能損傷線粒體進行選擇性識別，依賴溶酶體將其進行降解，實現(xiàn)線粒體成分的循環(huán)利用，以維持細胞穩(wěn)態(tài)[3]。

細胞線粒體自噬與非選擇性自噬在信號調(diào)節(jié)上有共享通路，但線粒體自噬也有自身特異性調(diào)節(jié)通路，如Pink1/Parkin 信號參與膜電位下降線粒體的清除[4]。目前發(fā)現(xiàn)線粒體自噬也可由線粒體膜定位受體介導發(fā)生，例如Bnip3和Bnip3L(Nix)擁有高度序列同源性，作為線粒體自噬受體蛋白, 定位于線粒體外模，通過自身LIR區(qū)域與自噬標記物微管相關(guān)蛋白輕鏈-3 (LC3) 結(jié)合，促進線粒體被自噬體包裹，誘導線粒體自噬的發(fā)生[5]。營養(yǎng)限制能增強各類組織細胞自噬的發(fā)生[6]；各類運動也能促進骨骼肌自噬的發(fā)生[7]。但是運動對骨骼肌線粒體自噬的影響研究相對較少，運動和飲食限制對骨骼肌線粒體自噬有何影響還不知曉，兩種因素干預是否能產(chǎn)生更強線粒體自噬信號，還不知道。本研究關(guān)注線粒體自噬受體信號途徑，考察運動和飲食限制對小鼠骨骼肌Bnip3/Nix的影響，為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及干預方法

C57BL/6雄性小鼠(8周)32只，按體重隨機分為安靜對照組(C組)、飲食限制組(D組)、運動訓練組(E組)、運動訓練+飲食限制組(DE組)，8只/組。C組小鼠不做任何干預；D組小鼠限制飲食，每天投放量為C組消耗量的60%；E組進行10周游泳運動，1次/天，5天/周，第一周每次20 min，之后每周訓練時間增加10 min，第8～10周維持在每次90 min；DE組同時進行運動和飲食干預，方案與E組和D組相同。訓練前和訓練干預結(jié)束后稱量體重，訓練結(jié)束1 d后，麻醉處死提取腓腸肌，液氮速凍超低溫保存。

1.2 Western blot檢測蛋白

稱取30 mg腓腸肌組織，使用裂解液400 μl(碧云天公司提供)勻漿裂解，低溫離心機12 000 g 離心10 min，獲取總蛋白上清液。蛋白上樣后進行電泳(濃縮膠80 v，分離膠110 v恒壓)(Bio-Rad Mini-Protean電泳槽)，然后將分離膠蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，洗滌后脫脂牛奶37℃封閉2 h。一抗孵育過夜， Bnip3、Nix一抗(Boster Biological Technology)稀釋濃度均為1∶600，GAPDH抗體(碧云天公司提供)稀釋濃度為1∶1 000。洗滌后加二抗(1∶1 000，碧云天公司提供)，洗滌后加ECL發(fā)光液(碧云天公司提供)，凝膠成像系統(tǒng)獲得目的蛋白灰度，GAPDH作為內(nèi)參對目的蛋白表達進行校正。C組均值轉(zhuǎn)化為1，觀察其它組的相對表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 運動訓練及飲食限制前后小鼠體重變化

實驗前各組小鼠體重無顯著性差異(P>0.05)。實驗干預結(jié)束后，只有C組體重增長具有顯著性差異(P<0.05)。實驗后，D、E及DE組體重均顯著小于C組(P<0.01)。實驗前后各組體重增長量也呈現(xiàn)類似結(jié)果，D、E及DE組體重增加水平均顯著小于C組(P<0.01，表1)。

GroupBefore intervention(g)After intervention(g)Change of weight(g)C21.65±0.4630.18±1.28#8.53±1.59D21.58±0.9522.98±0.79??1.40±1.11??E22.02±1.0426.88±1.56??4.86±1.70??DE21.64±1.1522.81±1.52??1.18±1.42??

C: Control group; D: Dietary restriction group; E: Exercise training group; DE: Dietary restriction and exercise training group

**P<0.01vsC group；#P<0.05vsbefore intervention

2.2 運動訓練及飲食限制對小鼠骨骼肌Bnip3/Nix信號的影響

與對照組相比，運動和飲食限制均不同幅度提高小鼠腓腸肌Bnip3和Nix蛋白表達。D組、E組及DE組干預模式均提高Bnip3蛋白表達，增長幅度分別為13%、7%及17%，且均無顯著性差異(P>0.05)。Nix呈現(xiàn)類似表現(xiàn)，相比C組，D組、E組及DE組分別增長了10%、14%及25%，僅DE組Nix表達顯著高于C組(P<0.05)，具有顯著性差異(圖1)。

Fig.1The expressions of Bnip3 (A) and Nix (B) after exercise training and dietary restriction(n=8)

3 討論

骨骼肌是瘦體重的主要組成成分，本研究發(fā)現(xiàn)運動訓練和飲食限制均可單獨延緩體重的增長，而且飲食限制加運動訓練對體重增長影響更顯著，其增長幅度最小，提示本次運動訓練和飲食限制對小鼠體重增長的抑制具有疊加效應(yīng)，在飲食限制的基礎(chǔ)上，運動訓練可能更有效控制體重。骨骼肌線粒體是能量合成“工廠”，肌細胞線粒體自噬的應(yīng)激變化和適應(yīng)調(diào)節(jié)對骨骼肌生理功能的維持起重要作用，線粒體自噬配合線粒體合成共同維護骨骼肌線粒體的質(zhì)量[8]。敲除肌細胞自噬相關(guān)基因，一次性運動誘發(fā)的骨骼肌細胞線粒體自噬被抑制，同時糖酵解更易被動員，有氧能力降低[9]，提示線粒體自噬在骨骼肌能量代謝適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Bnip3、Nix定位于線粒體外模，可直接通過其LIR結(jié)構(gòu)與自噬體LC3進行結(jié)合，誘導自噬體包裹損傷線粒體，促進自噬發(fā)生[10]。運動訓練對骨骼肌Bnip3/Nix途徑研究較少，本文予以關(guān)注。

本次研究發(fā)現(xiàn)飲食和運動訓練均可提高Bnip3、Nix蛋白表達，但Bnip3對三種干預方法的敏感度相對不如Nix，三種干預模式均提高Bnip3表達，但均無顯著性；只有飲食限制加運動訓練的復合干預模式能顯著提高Nix的表達，提示運動和飲食干預促進Nix表達可能對線粒體自噬的發(fā)生起到促進作用。前期有研究發(fā)現(xiàn)4周主動轉(zhuǎn)輪訓練可以有效提高小鼠跖肌Bnip3表達，但有氧代謝為主的比目魚肌Bnip3表達卻無顯著變化[11]，認為運動訓練對無氧酵解為特征的肌肉Bnip3影響更顯著。但本研究選取的無氧酵解為主的腓腸肌卻沒有呈現(xiàn)這種表現(xiàn)，訓練周期和運動方式的差異可能是研究矛盾的原因。有研究發(fā)現(xiàn)70%最大攝氧量強度蹬車2 h能顯著提高人體骨骼肌Bnip3、Nix 蛋白表達[12]。提示Bnip3/Nix信號對一次性運動可能更敏感。Bnip3/Nix信號對低氧比較敏感，可能一次性運動能更易產(chǎn)生缺氧刺激，長期訓練骨骼肌存在適應(yīng)過程，對缺氧存在耐受，可能導致一次運動和長期運動訓練對Bnip3/Nix信號影響不同。

運動訓練加飲食限制能有效促進Nix蛋白表達，有利于線粒體自噬啟動。其它線粒體調(diào)節(jié)途徑，如運動訓練對Pink1/Parkin、Fundc1有何種影響，還有待繼續(xù)研究。