陳惠花, 朱梅菊△, 朱洪竹, 丁孝民， 王 卉, 毛澤華

(1. 井岡山大學(xué)體育學(xué)院, 江西 吉安 343009； 2. 井岡山大學(xué)后勤保障處, 江西 吉安 343009)

石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的干燥根莖, 為延年、益智的要藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，屬于增力類(lèi)中藥之一[1]。研究表明：石菖蒲具有明顯的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用[2]。目前大量研究證實(shí)，當(dāng)機(jī)體處于疲勞狀態(tài)時(shí)，學(xué)習(xí)記憶功能受到明顯抑制[3-4]。石菖蒲對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響報(bào)道較多[5]。但石菖蒲對(duì)疲勞運(yùn)動(dòng)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶影響的報(bào)道甚少。5-羥甲基糠醛是本課題組從大理產(chǎn)石菖蒲A.tatarinowii中分離得到的化合物[6 ]。近年該化合物的生物活性作用受到高度重視[7]。以往對(duì)石菖蒲改善學(xué)習(xí)記憶的活性成分主要集中在細(xì)辛醚部分，對(duì)5-羥甲基糠醛研究甚少。為此，本研究擬運(yùn)用運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠模型，研究石菖蒲及其活性成分-5-羥甲基糠醛改善疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠學(xué)習(xí)記憶和對(duì)海馬信號(hào)分子-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 和cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein, CREB)表達(dá)的影響，為尋找新的改善學(xué)習(xí)記憶活性成分及指導(dǎo)石菖蒲在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與給藥方法

80只、6周齡、清潔級(jí)的雄性SD大鼠，體重(201±17)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物合格證為：SCXK(湘)2011-0003，動(dòng)物使用證為：SYXK(贛)2017-0003)。分籠飼養(yǎng)，自然光照，動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度(20±3)℃，相對(duì)濕度為40%～60%。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后, 按完全隨機(jī)法分為正常組(A)、運(yùn)動(dòng)組( B )、運(yùn)動(dòng)+5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組(C、D、E)、運(yùn)動(dòng)+石菖蒲低、中、高劑量治療組( F、G、 H )，共8組，每組10只。石菖蒲低、中、高劑量組分別按石菖蒲提取物0.12、1.20和4.80 g. kg-1. wt-1，5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組分別按5-羥甲基糠醛 0.10、1.00和3.00 mg. kg-1. wt-1，灌胃。每天灌胃1次；正常組、運(yùn)動(dòng)組以等體積生理鹽水灌胃，藥物劑量換算參照文獻(xiàn)[8]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每次灌胃時(shí)間在運(yùn)動(dòng)前2 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)間10 d。

1.2 石菖蒲提取物的制備

石菖蒲1 kg，首先運(yùn)用二氧化碳超臨界萃取法提取石菖蒲揮發(fā)油。然后將藥物殘?jiān)?5%乙醇分別熱提3次，減壓濃縮成浸膏。再將乙醇提取后的藥物殘?jiān)盟逯?次，在60℃水浴中濃縮成浸膏(每克浸膏含生藥10 g)。最后將此三者合并成石菖蒲混合提取物，放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ牌烟崛∥镏泻笑?細(xì)辛醚1.35% 和5-羥甲基糠醛 0.015%。

1.3 石菖蒲中5-羥甲基糠醛的分離提取

按文獻(xiàn)[6]，具體為：干燥石菖蒲15 kg，粉碎后先用超臨界CO2萃取儀提取揮發(fā)油。其殘?jiān)?5%乙醇熱提3次，減壓蒸餾得浸膏1 kg。將浸膏溶于蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑得乙酸乙酯部分200 g和正丁醇部分250 g。用氯仿-甲醇 ( 9∶1 ～ 1∶1) 對(duì)乙酸乙酯部分進(jìn)行硅膠柱色譜分離，梯度洗脫，分得10個(gè)部分( F1～F10)。取其中第9部分-F9( 10 g) 經(jīng) Sephadex LH-20 色譜柱分離，氯仿-甲醇( 2∶1) 洗脫，得到5-羥甲基糠醛( 400 mg)。放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 疲勞運(yùn)動(dòng)方案

疲勞運(yùn)動(dòng)方案按文獻(xiàn)[9]。B-H組動(dòng)物首先進(jìn)行3 d 適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練, 隨后開(kāi)始10 d 的正式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。負(fù)荷分為3級(jí)，每級(jí)跑速分別為8、15、20 m/min，第1、2級(jí)分別運(yùn)動(dòng)15 min，第3級(jí)運(yùn)動(dòng)直至大鼠無(wú)法維持跑臺(tái)預(yù)定跑速，滯留于跑道后端3次以上，使用聲波和光、電刺激驅(qū)趕仍無(wú)效，并伴有呼吸急促，腹臥跑臺(tái)等行為表現(xiàn)。正常組動(dòng)物相同條件常規(guī)飼養(yǎng), 不參加跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

1.5 水迷宮實(shí)驗(yàn)程序

采用Morris水迷宮(淮北正華)實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮測(cè)試采用圓形水池(直徑120 cm，高60 cm)，水溫(22±1)℃，低于水面1 cm 處放置一個(gè)全透明的塑料圓形平臺(tái)(直徑10 cm，高50 cm)，迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí)并記錄大鼠游泳軌跡。水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.5.1 定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation test, PNT) 動(dòng)物購(gòu)入后，進(jìn)行PNT訓(xùn)練3 d。PNT訓(xùn)練即：大鼠自由游泳15 min，使大鼠熟悉水池。然后將大鼠隨機(jī)從東、西、南、北4個(gè)入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄大鼠在2 min 內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency)。如果大鼠在2 min 內(nèi)未找到平臺(tái)，采集系統(tǒng)將自動(dòng)關(guān)閉，潛伏期按2 min計(jì)算。然后將大鼠引到平臺(tái)上停留 15 s，2次訓(xùn)練間隔3～5 min。每只大鼠每天接受3次PNT訓(xùn)練，連續(xù)3d。第4日進(jìn)行PNT測(cè)驗(yàn)，取3次潛伏期平均值作為逃避潛伏期。水迷宮測(cè)驗(yàn)結(jié)束后B-H 組大鼠進(jìn)行10日跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)第7、8、9日，所有大鼠均需進(jìn)行PNT訓(xùn)練。第10日跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，所有大鼠進(jìn)行PNT測(cè)驗(yàn)，重復(fù)3次。

1.5.2 空間位置探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test, SPT) 用于測(cè)量大鼠對(duì)平臺(tái)空間位置的準(zhǔn)確記憶，即記憶保持能力。每次PNT測(cè)驗(yàn)結(jié)束后，撤去平臺(tái)，從同一入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄大鼠2 min內(nèi)，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.6 腦組織的取材

最后一次SPT測(cè)試結(jié)束后即刻，用25%烏拉坦和0.9%戊巴比妥鈉混合液按0.4 ml/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血后，冰浴中快速剝離雙側(cè)海馬(稱(chēng)量), 置液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱。保存待測(cè)。

1.7 免疫印跡法(Western blot)

在冰浴上用組織勻漿器制備海馬腦組織勻漿液，用15 000 g、4℃低溫離心15 min，吸取其上清。再重復(fù)離心一次。用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)量。樣品蛋白用10.0% SDS-PAGE 分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液(含5.0 % 脫脂奶粉， 3.0% BSA，0.1%Tween-TBS)進(jìn)行非特異性封閉常溫2 h，洗滌4次，分別加入抗p-ERK1/2(按滴度1∶1 500 稀釋)、 抗p-CREB (按滴度1∶2 000 稀釋)(美國(guó)Sigma公司)，4℃過(guò)夜。0.1% Tween-TBS 沖冼5 次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗HRP-IgG (按滴度1∶1000 稀釋,北京中山生物技術(shù)有限公司) 37℃孵育2 h。0.1% Tween-TBS 沖冼6 次，加入ECL試劑(化學(xué)發(fā)光劑，美國(guó)Primer公司)進(jìn)行曝光，X 線(xiàn)片記錄影像。應(yīng)用Fluorchem V 2.0 系統(tǒng)進(jìn)行吸光度測(cè)定,以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH 的平均吸光度比值表示蛋白水平,進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能比較

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù),差異無(wú)顯著性(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)后B組大鼠逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于A、D、E、G、H組，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于A、D、E、G、H組，差異具有顯著性(P均< 0.01), 但C、F、B組上述指標(biāo)差異無(wú)顯著性(P均> 0.05)。5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期依次為: C > D >E，而穿越平臺(tái)次數(shù)則相反(P均<0.01)。

石菖蒲提取物低、中和高劑量組上述指標(biāo)的變化趨勢(shì)與5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組相同。5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期分別與石菖蒲提取物低、中和高劑量比較，有延長(zhǎng)的趨勢(shì)，而穿越平臺(tái)次數(shù)則有減少趨勢(shì)，但差異均無(wú)顯著性，(P均>0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of learning and memory functions among groups before and after n= 10)

A: Control group； B: Exercise group； C: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-L； D: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-M, E: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-H； F: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-L； G: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-M； H: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-H

**P<0.01vscontrol group (A);##P<0.01vsexercise group (B);△△P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-M (D);▲▲P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-H(E);○○P<0.01 exercise+AcorustatarinowiiSchott-M (G) ；●●P<0.01vsexercise+AcorustatarinowiiSchott-H (H)

2.2 各組大鼠海馬信號(hào)分子P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較

各組大鼠海馬p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)圖1 。由圖1 可知B組大鼠海馬p-ERK1蛋白表達(dá)水平顯著低于A、D、E、G、H組(P<0.01或P< 0.05), 但與C、F組比較，差異無(wú)顯著性(P均> 0.05)。5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組大鼠海馬p-ERK1蛋白表達(dá)水平依次為: C < D < E, 均P< 0.01。石菖蒲提取物低、中和高劑量組大鼠海馬p-ERK1蛋白表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組相同。5-羥甲基糠醛中劑量組大鼠海馬p-ERK1蛋白表達(dá)水平低于石菖蒲提取中劑量組(P<0.05), 但5-羥甲基糠醛低、高劑量組大鼠海馬p-ERK1蛋白表達(dá)水平分別與石菖蒲提取物低和高劑量組比較,差異無(wú)顯著性,均P>0.05。海馬P-ERK2蛋白表達(dá)水平除E組低于A和H組,P< 0.05外, 其變化趨勢(shì)與P-ERK1相同。

Fig.1Comparison of the levels ofp-ERK1/2 protein expression in hippocampus among groups

A: Control group； B: Exercise group; C: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-L; D: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-M; E: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-H; F: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-L; G: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-M; H: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-H

**P<0.01vscontrol group (A);#P<0.05,##P<0.01vsexercise group (B);△△P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-M (D);▲▲P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-H(E);○P<0.05,○○P<0.01 exercise+AcorustatarinowiiSchott-M (G);●●P<0.01vsexercise+AcorustatarinowiiSchott-H (H)

2.3 各組大鼠海馬信號(hào)分子P-CREB蛋白表達(dá)比較

各組大鼠海馬信號(hào)分子p-CREB蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)圖2。由圖2可知B組大鼠海馬P-CREB蛋白表達(dá)水平顯著低于A、D、E、G、H組(P<0.01或P<0.05), 但與C、F組比較，差異無(wú)顯著性(P均> 0.05)。5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組大鼠海馬P-CREB蛋白表達(dá)水平依次為: C < D < E(P均< 0.01)。石菖蒲提取物低、中和高劑量組大鼠海馬P-CREB蛋白表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與5-羥甲基糠醛低、中、高劑量組相同。5-羥甲基糠醛中劑量組大鼠海馬P-CREB蛋白表達(dá)水平低于石菖蒲提取中劑量組(P<0.01), 但5-羥甲基糠醛低、高劑量組大鼠海馬P-CREB蛋白表達(dá)水平分別與石菖蒲提取物低、高劑量組比較,差異無(wú)顯著性(P均>0.05)。

Fig.2Comparison of the levels ofp-CREB protein expression in hippocampus among groups

A: Control group; B: Exercise group; C: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-L; D: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-M; E: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-H; F: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-L; G: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-M; H: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-H

**P<0.01vscontrol group (A);#P<0.05,##P<0.01vsexercise group (B);△△P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-M (D);▲▲P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-H(E);○P<0.05,○○P<0.01 exercise+AcorustatarinowiiSchott-M (G) ;●●P<0.01vsexercise+AcorustatarinowiiSchott-H (H)

3 討論

當(dāng)機(jī)體處于疲勞狀態(tài)時(shí)，學(xué)習(xí)記憶功能受到明顯抑制。因此尋找有效的藥物改善疲勞機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶功能，意義重大。目前改善疲勞運(yùn)動(dòng)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶下降的藥物研究主要有兒茶素沒(méi)食子酸酯( epigallocatechin gallate, EGCG)和螺旋藻[10-11 ]等。中藥石菖蒲(acorustatarinowiiSchott)為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的干燥根莖。改善機(jī)體學(xué)習(xí)記憶是石菖蒲的主要藥理作用之一[12]，但有關(guān)石菖蒲改善疲勞運(yùn)動(dòng)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶方面的報(bào)道甚少。本研究結(jié)果表明石菖蒲能明顯改善疲勞機(jī)體學(xué)習(xí)記憶功能，并隨其劑量的增加,其作用增強(qiáng)。

有關(guān)石菖蒲改善機(jī)體學(xué)習(xí)記憶的活性成分主要集中在石菖蒲揮發(fā)油中的β-細(xì)辛醚[13-14]。而近年研究表明石菖蒲水煎液同樣具有較好的改善機(jī)體學(xué)習(xí)記憶作用[15]。提示石菖蒲改善機(jī)體學(xué)習(xí)記憶的活性成分可能不僅僅是揮發(fā)油中的細(xì)辛醚部分，對(duì)此值得深入研究。5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural, 5-HMF)是本室從石菖蒲的水煎液中分離提取的產(chǎn)物[6]。本研究結(jié)果表明從石菖蒲水煎液中分離得到的5-羥甲基糠醛亦能較明顯地改善疲勞運(yùn)動(dòng)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶功能。

近年來(lái),神經(jīng)系統(tǒng)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的研究成為新熱點(diǎn)[16-17]。ERK 廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在海馬和前額葉皮質(zhì)的表達(dá)尤其顯著，其磷酸化形式能夠介導(dǎo)胞外信息向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增殖、分化和提高學(xué)習(xí)記憶等方面起重要作用[18-19]。ERK信號(hào)通路與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[20]。ERK信號(hào)途徑可能是多種海馬突觸可塑性誘導(dǎo)的共同機(jī)制[21-22]。CREB 是 ERK 最重要的下游信號(hào)分子之一，ERK 信號(hào)通路在調(diào)節(jié) CREB 磷酸化方面起關(guān)鍵作用，可通過(guò)磷酸化其下游信號(hào)分子CREB 而調(diào)節(jié)CREB、ELK的活性, 進(jìn)而激活記憶相關(guān)基因表達(dá), 參與記憶和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)的調(diào)控[23]。有研究表明適宜運(yùn)動(dòng)能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)ERK與CREB 的磷酸化水平持續(xù)升高，從而有益于學(xué)習(xí)記憶[24]。本研究結(jié)果表明：疲勞運(yùn)動(dòng)后大鼠海馬腦組織P-ERK1/2和p-CREB蛋白表達(dá)水平明顯下降，提示ERK-CREB 信號(hào)通路下調(diào)可能參與疲勞運(yùn)動(dòng)致學(xué)習(xí)記憶受損的機(jī)制。

研究表明石菖蒲-遠(yuǎn)志藥對(duì)能促進(jìn)AD模型大鼠海馬內(nèi)突觸蛋白的表達(dá)，尤以水提物組分效果明顯[25]。石菖蒲能通過(guò)保護(hù)神經(jīng)元和增強(qiáng)海馬突觸可塑性，改善癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能[26]。本研究表明：石菖蒲能明顯提高疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠海馬腦組織P-ERK1/2和p-CREB蛋白表達(dá)水平。而ERK信號(hào)途徑又可能是多種海馬突觸可塑性誘導(dǎo)的共同機(jī)制[21-22]。提示上調(diào)海馬ERK信號(hào)可能是石菖蒲改善機(jī)體學(xué)習(xí)記憶的重要作用機(jī)制之一。研究表明5-羥甲基糠醛能改善腦缺血/再灌注模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)理與糾正自由基代謝失衡有關(guān)[27]。從地黃中分離得到的5-羥甲基糠醛，能明顯上調(diào)海馬神經(jīng)元中與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的信號(hào)分子，包括：p-ERK，p-CREB和BDNF 等[28]。本研究表明從石菖蒲水煎液中分離得到的5-羥甲基糠醛能明顯改善疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶，并能提高疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠海馬腦組織P-ERK1/2和p-CREB蛋白表達(dá)水平，提示5-羥甲基糠醛可能是石菖蒲水提物改善學(xué)習(xí)記憶的主要活性成分之一，其作用機(jī)理與5-羥甲基糠醛上調(diào)海馬ERK/CREB信號(hào)有關(guān)。但石菖蒲及其活性成分-5-羥甲基糠醛對(duì)海馬ERK/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用強(qiáng)度的大小，還需進(jìn)一步應(yīng)用激活劑或抑制劑進(jìn)行觀(guān)察。

綜上,本研究結(jié)果表明石菖蒲及其活性成分-5-羥甲基糠醛能明顯改善疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠學(xué)習(xí)記憶，其機(jī)理與其提高海馬p-ERK1/2和p-CREB蛋白表達(dá)水平有關(guān)。5-羥甲基糠醛可能是石菖蒲改善機(jī)體學(xué)習(xí)記憶的活性成分之一。為石菖蒲在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用及新的益智類(lèi)藥物研發(fā)提供了新的思路。