張建東，王懸峰，彭 灣，呂瑋鑫，吳素珍，肖 海

(1.江西醫(yī)學高等?？茖W校，江西 上饒 334000；2.贛南醫(yī)學院 a.基礎(chǔ)醫(yī)學院；b.第一附屬醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病中嚴重的并發(fā)癥之一，引起腎小球硬化和腎功能損害[1]。目前，DN發(fā)病機制包括高糖、糖基化終末產(chǎn)物、炎癥因子以及氧化應激誘導等[2]。自噬是維持腎臟細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)不可或缺的生理活動，在上述損傷機制中起著重要作用[3]。目前國內(nèi)外對DN尚無確切有效的治療方法。因此，尋找有效防治DN的新方法具有重要的實際意義。

二氫楊梅素(dihydromyricelin，DMY)是藤茶中主要成分之一。DMY具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗纖維化等多種生物活性作用[4-6]。研究表明，DMY具有降血糖作用，能有效改善糖耐量異常狀態(tài)[7-8]。DMY還能通過增強自噬活性保護高糖誘導的臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷[9]。然而，DMY在糖尿病動物腎臟自噬的作用尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)自噬與DN的發(fā)生發(fā)展共同受到Sirt1信號通路的調(diào)控[10]。本文通過建立DN大鼠模型，探討Sirt1/自噬信號通路在DMY抗糖尿病腎損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1動物和試劑雄性SD大鼠40只，體重為(200±20) g，由贛南醫(yī)學院動物中心提供。將動物置于25 ℃環(huán)境下飼養(yǎng)，普通飼料喂食，自由飲水，適應性喂養(yǎng)1周。Sirt1、Beclin-1抗體購自于英國Abcam公司。Bcl-2、Bax購自于武漢博士德公司；LC3購自于美國proteintech公司；二抗購自于福州邁新公司，二氫楊梅素購自成都德思特公司，鏈脲佐菌素(STZ)購自于北京索萊寶公司。

1.2 DN模型的制備和實驗分組大鼠禁食不禁水12 h后，除正常對照組外均采用55 mg·kg-1STZ一次性腹腔注射大鼠并給予普通飼料喂養(yǎng)12周后建立DN模型。造模72 h后大鼠尾靜脈取血測空腹血糖，以血糖>16.7 mmol·L-1視為造模成功。將大鼠隨機分為模型組和低、中、高劑量DMY組(DMY濃度分別為125 mg·kg-1、250 mg·kg-1、500 mg·kg-1)，每組8只，另設(shè)正常對照組8只。DMY組采用灌胃給藥，模型組和正常對照組以等量的生理鹽水灌胃，每天一次，持續(xù)12周。

1.3透射電鏡觀察自噬水平將腎臟組織置于2.5%戊二酸緩沖液中固定2 h，再用四氧化鋨固定液固定2 h，PBS沖洗，依次置于不同濃度的乙醇中脫水。包埋處理后，將腎臟組織切片并進行染色，透射電鏡下觀察樣本并拍照。

1.4免疫組化檢測蛋白水平腎臟組織切片常規(guī)脫蠟至水，采用檸檬酸高壓修復抗原，PBS沖洗后甩干。分別加入LC3、Bcl-2、Bax抗體37 ℃孵育1 h，PBS做陰性對照，PBS沖洗，滴加二抗孵育15 min。DAB顯色，蘇木精復染。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下采集圖像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。計算各組大鼠腎臟組織中LC3、Bcl-2、Bax陽性表達的平均光密度。

1.5 Westernblot檢測蛋白水平腎臟組織充分裂解1 h后采用BCA方法進行蛋白定量，將蛋白煮沸變性，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后，加入Sirt1、Beclin-1一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h。最后用Bio-Rad軟件掃描蛋白條帶及測定灰度值，并與對照組結(jié)果進行對比。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎臟組織的自噬水平比較DMY給藥12周，通過透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組腎臟組織系膜區(qū)可見低密度電子致密物，基底膜明顯增厚，足細胞線粒體輕度腫脹，但都未見自噬體。與模型組比較，中劑量DMY組可見少量自噬體，但基底膜未見明顯增厚(圖1)。通過免疫組化進一步檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組自噬關(guān)鍵蛋白LC3表達水平下降(P<0.05)。DMY各劑量組相較于模型組LC3蛋白水平出現(xiàn)不同程度的增加(P<0.05)，見表1和圖2。

2.2 DMY對各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax表達水平的影響免疫組化檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組腎臟組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax表達水平顯著增加，Bcl-2蛋白表達水平下降(P<0.01)。與模型組比較，各劑量DMY組凋亡相關(guān)蛋白Bax出現(xiàn)不同程度的降低，而Bcl-2蛋白表達水平增加(P<0.05)，見表1和圖2。

①正常對照組；②模型組；③中劑量DMY組。

組別LC3Bcl-2Bax正常對照組1.75±0.320.97±0.220.45±0.12模型組1.29±0.23?0.42±0.15??1.08±0.21??低劑量DMY組1.72±0.34#0.74±0.18#0.76±0.18#中劑量DMY組1.66±0.27#1.13±0.25##0.41±0.14##高劑量DMY組1.88±0.35##1.18±0.23##0.48±0.15##P<0.05<0.01<0.01

注：與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

①正常對照組；②模型組；③低劑量DMY組；④中劑量DMY組；⑤高劑量DMY組。

2.3 DMY對各組大鼠腎組織中Sirt1和Beclin-1表達水平的影響Western blot檢測結(jié)果顯示各組腎臟組織中Sirt1、Beclin-1蛋白表達有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，與正常對照組比較，模型組腎臟組織中Sirt1、Beclin-1蛋白表達水平下降(P<0.05)。DMY處理后，低、高劑量DMY組相較于模型組可顯著促進腎臟組織中Sirt1、Beclin-1蛋白的表達(P<0.05)，見圖3。

①Sirt1蛋白條帶；②各組Sirt1蛋白表達水平的比較；③Beclin-1蛋白條帶；

3 討 論

自噬是一種高度保守的“自食”途徑，通過溶酶體降解途徑清除細胞內(nèi)的細胞毒性物質(zhì)以及受損的細胞器以維持細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和完整性。自噬在人類健康和疾病中起著重要作用，其是維持腎小球和腎小管平衡的重要機制[11]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬活性受損引起糖尿病條件下的腎小球和腎間質(zhì)病變，表明自噬受損與DN的發(fā)病機制有關(guān)[12]。本文也發(fā)現(xiàn)模型組相較于正常對照組腎臟組織中自噬關(guān)鍵蛋白LC3表達水平下降，而凋亡相關(guān)蛋白Bax表達水平增加，Bcl-2表達水平下降，提示高糖環(huán)境可引起大鼠腎臟損傷。因此，以自噬途徑為靶點激活或恢復自噬活性可能具有腎臟保護作用。

近年來發(fā)現(xiàn)DMY能誘導癌細胞自噬，還能促進細胞自噬抑制高脂誘導動脈粥樣硬化[13]。另外，DMY還能促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1的表達[14]。這些研究表明DMY可以正向調(diào)控細胞自噬，但DMY能否通過影響細胞自噬對DN產(chǎn)生保護作用尚不清楚。自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，Atg)在自噬過程中發(fā)揮重要作用，它控制自噬途徑的主要步驟，如自噬泡的誘導、延伸以及自噬體和自噬溶酶體的形成。Beclin-1是哺乳動物中調(diào)控自噬的重要因子，Beclin-1可誘導前自噬體結(jié)構(gòu)的形成，促進自噬泡的產(chǎn)生[15]。Beclin-1與幾種配體結(jié)合發(fā)揮多種生物學效應，包括調(diào)控細胞代謝、凋亡和自噬[16]。研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1與PI3K相互作用促進LC3的加工導致自噬活性的增加，而與Bcl-2相互作用抑制細胞凋亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMY能促進糖尿病腎組織中Beclin-1、LC3蛋白的表達和自噬體的形成，從而增強DN細胞自噬活性。此外，DMY能抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達。這些結(jié)果表明DMY通過促進自噬，抑制細胞凋亡來發(fā)揮對DN大鼠的保護作用。

沉默信息調(diào)控因子1(silence information regulator 1，Sirt1)是一種高度保守的NAD+依賴的組蛋白去乙?；福c自噬體的形成密切相關(guān)。Sirt1去乙酰化自噬相關(guān)蛋白(如Atg5、Beclin-1、LC3等)促進細胞自噬[18]。Beclin-1的表達水平與其賴氨酸殘基的乙?；嘘P(guān)，其乙酰化可抑制自噬體形成。Sirt1對Beclin-1賴氨酸殘基的去乙?；绊懽允审w的形成和隨后的生物學效應，表明Beclin-1是Sirt1的一個去乙?；悬c。因此，可通過Beclin-1的去乙?；瘉砘謴虳N自噬活性發(fā)揮腎保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病肥胖大鼠模型中通過飲食控制可恢復Sirt1水平，繼而通過提高細胞自噬活性和改善線粒體功能發(fā)揮腎保護作用[19]。在人類糖尿病受試者，Sirt1可調(diào)控足細胞的功能防止蛋白尿的產(chǎn)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMY能上調(diào)糖尿病腎臟組織中Sirt1、Beclin-1蛋白的表達。提示DMY可能通過Sirt1對自噬相關(guān)蛋白的去乙?；瘉泶龠M細胞自噬發(fā)揮腎保護作用。

總之，本文通過建立DN大鼠模型，初步證明DMY可能是通過激活Sirt1/自噬信號通路來促進細胞自噬和抑制細胞凋亡，繼而對DN大鼠腎臟產(chǎn)生保護作用。本文為DMY用于DN的預防和治療提供理論和實踐參考價值。