卓 然 王 楊 劉 剛 章登輝 龔 慧

我國糖尿病患者已超過1億人，大約30%的患者會發(fā)生皮膚破潰，由于局部神經(jīng)和血管病變，糖尿病潰瘍常反復(fù)發(fā)生，難以愈合，嚴(yán)重者可因重度感染危及生命[1]。雖然目前治療糖尿病的方案眾多，但總體治療效果并不理想。孫曉磊等[2]研究表明糖尿病大鼠β-catenin表達(dá)降低，表皮細(xì)胞增殖能力下降，故認(rèn)為Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂與糖尿病創(chuàng)面難以愈合有關(guān)。富血小板纖維蛋白(PRF)是一種富含細(xì)胞因子和生長因子的自體來源的新型生物材料，Ding等[3]報(bào)道其可有效促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合。但是PRF促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合是否與Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)鮮有報(bào)道。因此，本研究通過檢測創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)β-catenin的表達(dá)水平，探索PRF對糖尿病創(chuàng)面愈合Wnt/β-catenin信號通路的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:40只8周齡雄性SD大鼠購于遼寧長生生物公司/遼寧何氏醫(yī)學(xué)院[許可證號：SCXK(遼)2015-0001，合格證號：211002300035410]，體重200～230g，平均體重218±3.57g。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，健康狀態(tài)良好后用于實(shí)驗(yàn)。

2.主要試劑與儀器設(shè)備：(1)主要實(shí)驗(yàn)試劑：鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)、枸櫞酸鈉緩沖液(美國索萊寶公司，貨號：C1013)、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物公司，批號：1805300031)、大鼠SP超敏試劑盒(福州邁新生物公司，批號：1805159710)、β-catenin一抗(美國Proteintech公司，批號：60008-1)、PBS磷酸鹽緩沖液(福州邁新生物公司，批號：18052202)、抗原修復(fù)緩沖液(福州邁新生物公司，批號：18042404)。(2)主要實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平(中國上海精密公司)、羅氏活力血糖儀及試紙(德國羅氏公司)、石蠟切片機(jī)(德國徠卡Leica)、75℃恒溫烤箱(中國福意公司)、光學(xué)顯微鏡(德國Lioo公司)、臺式離心機(jī)(中國吉迪儀器公司)、未加抗凝劑的玻璃采血管、透明網(wǎng)格紙。

3.實(shí)驗(yàn)方法：(1)糖尿病大鼠模型建立：大鼠禁食12h，腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液45mg/kg，1周后于尾靜脈測空腹血糖值。若空腹血糖值≥16.7mmol/L，則視為造模成功；若血糖值<16.7mol/L，則視為不成功，以劑量為30mg/kg的鏈脲佐菌素再次誘導(dǎo)，如仍不成功則剔除實(shí)驗(yàn)[4]。(2)糖尿病大鼠創(chuàng)面的制備：所有大鼠均以1%的水合氯醛(300mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后用10%的硫化鈉去除大鼠背部及側(cè)腹部毛發(fā)。用邊長22mm的正方形硬紙板及標(biāo)記筆在大鼠脊柱兩側(cè)各做一正方形標(biāo)記，造模前常規(guī)消毒，使用無菌手術(shù)剪及手術(shù)鑷沿標(biāo)記線剪出一邊長22mm的正方形缺損(面積為484mm2),創(chuàng)面深達(dá)淺筋膜層，此即為糖尿病大鼠創(chuàng)面模型。(3)PRF制備:用未加抗凝劑的真空采血管抽取8位志愿者的靜脈血，迅速置于離心機(jī)中，立即以3000r/min的速度離心10min。離心后試管內(nèi)血液分為3層，PRF位于底層深紅的紅細(xì)胞碎片和頂層淡黃色的貧血小板血漿澄清液之間，呈淡黃色凝膠狀。用無菌注射器針頭取出采血管內(nèi)凝膠條，修剪并保留PRF尾部少許紅細(xì)胞成分，即制備完成(圖1A、圖1B)。(4)分組及干預(yù)：選擇大鼠左側(cè)創(chuàng)面做為PRF組，右側(cè)創(chuàng)面為對照組。將制備的PRF膜片置于大鼠左側(cè)創(chuàng)面上，凡士林紗布覆蓋兩側(cè)創(chuàng)面后，無菌紗布包扎(圖1C)。每只大鼠均單籠飼養(yǎng)并依次編號，換藥時(shí)各創(chuàng)面均用1%碘伏消毒再以無菌紗布擦干后常規(guī)包扎。創(chuàng)面每日換藥1次，分別于操作后的3、7、14天使用隨機(jī)數(shù)字表法挑取大鼠注射過量麻藥處死并取創(chuàng)緣3mm內(nèi)皮膚組織做進(jìn)一步檢查。

圖1 PRF制備及應(yīng)用A.血液離心后；B.PRF凝膠；C.PRF覆蓋創(chuàng)面

4.觀察創(chuàng)面愈合情況：(1)創(chuàng)面面積及愈合率：術(shù)后即刻及3、7、14天采集創(chuàng)面照片，拍照時(shí)用刻度尺測量創(chuàng)面橫軸及縱軸長度，并用透明網(wǎng)格紙沿創(chuàng)面邊緣繪制創(chuàng)面圖形，拍取照片后用Image J軟件計(jì)算創(chuàng)面未愈合面積。愈合率計(jì)算公式為：愈合率=(創(chuàng)面原始面積-未愈合面積)/創(chuàng)面原始面積×100%。(2)HE染色：術(shù)后3、7、14天取創(chuàng)緣組織置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，脫蠟水化后蘇木素、伊紅染色。光鏡下選取5個(gè)200倍視野，觀察創(chuàng)面炎性反應(yīng)，并用圖像分析軟件測肉芽組織厚度。(3)SP免疫組化染色：根據(jù)SP免疫組化步驟進(jìn)行β-catenin的染色。光鏡下細(xì)胞質(zhì)呈棕色為β-catenin陽性，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的視野(×400倍)，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值作為陽性細(xì)胞的表達(dá)率。

結(jié) 果

1.糖尿病大鼠成模情況:40只大鼠經(jīng)腹腔注射STZ后，逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿、毛發(fā)無光澤、精神萎靡、活動(dòng)減少、蜷臥拱背等癥狀。大鼠腹腔注射STZ 1周內(nèi)共死亡4只，且主要集中在注射STZ后第3天。第1次注射STZ后共有16只大鼠空腹血糖值低于16.7mol/L，16只大鼠經(jīng)補(bǔ)注STZ后共死亡1只，1周后測空腹血糖小于16.7mol/L的共5只，給予剔除實(shí)驗(yàn)。故經(jīng)腹腔注射STZ后共計(jì)篩選出造模成功的糖尿病大鼠30只，體重180～210g，平均體重193±4.52g，較造模前體重有所減輕。隨后的實(shí)驗(yàn)中無大鼠異常死亡。

2.兩組創(chuàng)面愈合情況：造模后第3天，創(chuàng)面干燥、色澤紅潤，較少分泌物；PRF組與對照組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(22.1%±4.2% vs 20.5%±4.9%，t=1.358，P=0.180)。7、14天可見肉芽組織生長活躍、呈紅色、創(chuàng)緣形狀不規(guī)則，收縮與上皮化現(xiàn)象明顯；PRF組創(chuàng)面愈合率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(68.7%±10.6% vs 46.6%±9.2%，83.7%±2.2% vs 72.1%±3.4%，t=7.042、9.058，P均=0.001)，詳見圖2。

圖2 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)兩組創(chuàng)面大體觀

3.兩組創(chuàng)面HE染色的比較：造模后第3天，兩組創(chuàng)面均可見大量中性粒細(xì)胞浸潤，周圍組織水腫明顯，但PRF組肉芽組織水腫程度較對照組輕，肉芽組織厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1054±107 vs 1350±112，t=-6.043，P=0.001)。造模后第7、14天，PRF組中性粒細(xì)胞浸潤程度減輕明顯，伴有毛細(xì)血管增生，周圍組織水腫減輕，肉芽組織結(jié)構(gòu)致密，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(523±102 vs 1128±127，569±118 vs 682±124，t=-11.745、-2.272，P=0.001、0.036)，詳見圖3。

圖3 術(shù)后第14天兩組創(chuàng)面(HE，×200)A.PRF組；B.對照組

4.兩組創(chuàng)面β-catenin染色的比較：造模后第3、7、14天，兩組創(chuàng)面均出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)粗細(xì)不一的棕黃色陽性著色顆粒，但PRF組陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(39.2±7.8 vs 23.6±6.2，44.5±6.8 vs 25.8±5.8，44.9±5.5 vs 25.6±6.1，t=4.951、6.616、7.431，P均<0.05)，詳見圖4。

圖4 術(shù)后第14天兩組創(chuàng)面β-catenin(免疫組化,×400)A.PRF組；B.對照組

討 論

糖尿病創(chuàng)面難愈的具體機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為其與皮膚的特殊微環(huán)境、體內(nèi)免疫應(yīng)答功能障礙及相關(guān)細(xì)胞因子數(shù)量的改變有關(guān)，任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙均可使創(chuàng)面愈合延遲[5]。然而糖尿病患者又易于發(fā)生皮膚破潰，糖尿病人群中足部潰瘍年發(fā)生率為8.1%，年截肢(趾)率為5.1%，長期的治療費(fèi)用以及較差的預(yù)后效果極大的影響了患者的生存質(zhì)量，因此有必要探索新的治療手段，使創(chuàng)面的治療方案多元化[6]。

PRF是一種富含細(xì)胞因子和生長因子的自體來源的新型生物材料，其促進(jìn)創(chuàng)面愈合主要通過3個(gè)方面實(shí)現(xiàn)，分別為細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用、纖維蛋白的支架作用及白細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[7, 8]。首先，PRF含有多種生長因子，主要類型有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ-1)、血小板衍生生長因子(PDGF-AB)和表皮生長因子(EGF)。這些生長因子能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)及成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、組織修復(fù)。有研究表明β-catenin能夠通過調(diào)節(jié)TGF-β1來誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，尤其是皮膚成纖維細(xì)胞[9]。其次， PRF凝膠組織具有疏松、孔隙大、彈性好的特性，其結(jié)構(gòu)與人類天然的組織結(jié)構(gòu)非常相似。這一特性有利于組織在修復(fù)過程中發(fā)揮細(xì)胞支架作用；有利于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣彌散至細(xì)胞周圍；有利于誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)和增殖[10]。最后，PRF中滯納了大量白細(xì)胞，其在離心過程中被激活，在PRF降解過程中可不斷釋放免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子，發(fā)揮抗感染的作用[11]。因此，PRF對糖尿病創(chuàng)面具有一定的療效。

引起糖尿病創(chuàng)面的機(jī)制眾多，信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化是其中之一。Wnt/β-catenin信號通路具有高度的保守性，其與皮膚發(fā)育、創(chuàng)傷愈合關(guān)系密切， 表達(dá)增強(qiáng)時(shí)可促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化[12, 13]。正常情況下沒有Wnt信號的傳入，胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin在絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化下進(jìn)行降解，從而不發(fā)生表達(dá)。當(dāng)有Wnt信號傳入時(shí)，β-catenin由于不能被磷酸化降解，在胞質(zhì)中積累到一定程度后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活該通路[14]。Chen等[15]研究表明β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與皮膚發(fā)育、創(chuàng)傷愈合關(guān)系密切，可參與真皮和表皮結(jié)構(gòu)的形成。Xu等[16]研究表明在創(chuàng)面修復(fù)過程中，β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活并參與上皮的再生，提高了表皮細(xì)胞的增殖和遷移能力。

本研究揭示了PRF對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合情況及對Wnt/β-catenin信號通路的影響。本實(shí)驗(yàn)在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)記錄并計(jì)算出創(chuàng)面面積。通過分析認(rèn)為7～14天PRF組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯高于對照組，初步表明了PRF可以有效促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面的愈合。HE染色顯示PRF組中性粒細(xì)胞浸潤明顯減輕，肉芽組織結(jié)構(gòu)更加致密。SP免疫組化示PRF組β-catenin陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量高于對照組，提示了PRF能夠干擾Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使其表達(dá)水平升高，這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，PRF中多種生長因子的協(xié)同作用以及立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)作用使其在糖尿病創(chuàng)面治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。本研究表明，PRF能夠有效促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合，其作用機(jī)制與提高Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。