葉天民 彭鼎佳 肖 佳 楊樹標(biāo)

不孕癥是當(dāng)今困擾人類生殖繁衍的一大問(wèn)題。雖然目前已經(jīng)擁有了體外受精等輔助生殖技術(shù)，且適宜著床的內(nèi)膜、優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇等問(wèn)題均已得到解決，但臨床上許多胚胎移植以后仍然難以成功妊娠。其中的主要癥結(jié)之一在于胚胎的著床問(wèn)題。而不管對(duì)人類還是哺乳動(dòng)物而言，著床是在一定的時(shí)間才能發(fā)生的，這段時(shí)間稱之為著床窗。對(duì)人類而言，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞對(duì)于胚胎處于開放接受狀態(tài)的時(shí)間僅在著床窗那幾天，一般認(rèn)為是在排卵后的6～10天。對(duì)小鼠而言，著床窗一般在排卵后的4～5天。一旦錯(cuò)過(guò)了這個(gè)時(shí)間，著床將不能發(fā)生。

哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程中，胚胎著床是一個(gè)非常重要的事件。而且在哺乳動(dòng)物的不同物種之間，著床的幾個(gè)基本的步驟都是非常類似的，主要包括定位、黏著和侵入。定位指囊胚于內(nèi)膜表面不穩(wěn)定的黏著。此后，黏著步驟指囊胚滋養(yǎng)細(xì)胞開始具有黏著能力并黏于子宮內(nèi)膜表面。接下來(lái)滋養(yǎng)細(xì)胞穿破內(nèi)膜腔上皮層，侵入內(nèi)膜的間質(zhì)，即侵入過(guò)程。這些步驟是在母體甾體性激素的調(diào)控下完成的，并且需要胚胎和子宮之間和諧而精密的對(duì)話。該系列對(duì)話是由諸多分子通路所介導(dǎo)的，包括性激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、黏著分子和脂質(zhì)等[1]。而在子宮內(nèi)膜腔上皮處于對(duì)胚胎接受的著床窗時(shí)，上皮細(xì)胞的基膜、橋粒、細(xì)胞骨架及細(xì)胞質(zhì)會(huì)發(fā)生改變和變化。所以筆者預(yù)測(cè)子宮腔上皮細(xì)胞表面的一些蛋白對(duì)于胚胎的定位和黏著是非常至關(guān)重要的。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是目前一項(xiàng)研究蛋白質(zhì)有效而常用的方法。在筆者的研究中，并沒有將整塊子宮內(nèi)膜組織消化和蛋白提取處理后進(jìn)行分析，而是瞄準(zhǔn)了腔上皮細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究；因?yàn)椋驳脑缙陔A段就是在腔上皮表面發(fā)生。在本研究中，筆者將孕第1天(不接受胚胎階段)及孕第4天(接受胚胎階段)的小鼠腔上皮表面進(jìn)行了生物素結(jié)合標(biāo)記，然后提取表面蛋白后進(jìn)行二維電泳及質(zhì)譜分析。最后再進(jìn)行免疫組化學(xué)驗(yàn)證。

材料與方法

1.生物素標(biāo)記小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮表面：本研究所有健康雌性及雄性ICR和GFP小鼠由香港大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)均得到香港大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。將成年6～8周ICR雌性小鼠分別與正常雄性及行輸精管結(jié)扎術(shù)后的絕育雄性小鼠放在同一籠中過(guò)夜。第2天檢查雌性小鼠的陰道是否有白色精液栓。有栓的小鼠視為成功交配，此天為孕第1天或者假孕第1天。將與絕育雄鼠交配后假孕第1天及與正常雄性小鼠交配后孕第4天的ICR小鼠進(jìn)行麻醉。行開腹手術(shù)，暴露子宮，每側(cè)宮角處注射25μl生物素標(biāo)志物(0.25mg/ml，美國(guó)Thermo公司)，關(guān)腹腔縫合后放回籠內(nèi)。1h后，將小鼠處死，取出子宮后用眼科鑷分離出子宮內(nèi)膜后用磷酸緩沖液(PBS)沖洗3次。

2.生物素標(biāo)記蛋白的純化提?。悍蛛x出的小鼠子宮內(nèi)膜組織，用液氮處理后搗碎，用生物素標(biāo)記表面蛋白提取試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)中的裂解液溶解，離心后取上清液。根據(jù)試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟提取目標(biāo)蛋白質(zhì)，進(jìn)行后續(xù)的二維電泳。

3.二維雙向電泳及質(zhì)譜分析：二維電泳參考其他文獻(xiàn)的方法[2]。第一維電泳時(shí)每次上樣量為30μg，膠條為7cm IPG膠(非線性，pH值3～10，美國(guó)Bio-Red公司)，之后第二維電泳用12.5%的SDS-PAGE膠進(jìn)行分離，每一組均用5個(gè)樣本進(jìn)行二維電泳。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)銀染。膠樣用ImageScan的掃描儀(美國(guó)Amersham Biosciences公司)進(jìn)行高清掃描，得到的圖片運(yùn)用Image Master 2D Elite 4.01軟件(美國(guó)Amersham Biosciences公司)進(jìn)行對(duì)比分析。經(jīng)過(guò)軟件標(biāo)準(zhǔn)化分析后，有差異表達(dá)的蛋白對(duì)應(yīng)的膠上的點(diǎn)用刀片切出后進(jìn)行質(zhì)譜分析[3]。

4.免疫組化：小鼠內(nèi)膜組織經(jīng)過(guò)固定、石蠟包埋之后，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片制片。切片上組織厚度為5μm。切片經(jīng)脫蠟后進(jìn)行處理。GFP小鼠囊胚組內(nèi)膜直接加上羊抗兔二抗(1∶500)(丹麥Dako公司)處理0.5h，然后用ABC(生物素-辣根過(guò)氧化物酶)處理，最后用DAB顯色。其他組織切片則用傳統(tǒng)免疫組化的抗原修復(fù)、過(guò)氧化氫處理，加一抗(1∶100)、二抗(1∶500)后用ABC+DAB法顯色。其中一抗為兔抗鼠APN和intergrin β1(美國(guó)Santa Cruz公司)，二抗為羊抗兔IgG(丹麥Dako公司)。

結(jié) 果

1.標(biāo)記不接受胚胎階段及接受胚胎階段小鼠子宮內(nèi)膜表面蛋白:圖1為進(jìn)行免疫組化染色后的小鼠子宮內(nèi)膜組織切片，被生物素標(biāo)記的子宮內(nèi)膜表面有染色，而對(duì)照組未見染色。

2.不接受胚胎階段及接受胚胎階段小鼠子宮內(nèi)膜表面蛋白的二維電泳:將生物素標(biāo)記的小鼠子宮內(nèi)膜腔表面蛋白進(jìn)行分離純化后，進(jìn)行了二位電泳，圖2為兩個(gè)不同階段小鼠子宮內(nèi)膜表面蛋白二維電泳膠的掃描圖。通過(guò)Imagemaster軟件進(jìn)行分析后，筆者共發(fā)現(xiàn)了47個(gè)差異表達(dá)超過(guò)2倍的蛋白，其中接受胚胎階段高表達(dá)蛋白29個(gè)，不接受胚胎階段高表達(dá)蛋白18個(gè)；在這里面發(fā)現(xiàn)20個(gè)差異表達(dá)超過(guò)3倍的蛋白，其中接受胚胎階段高表達(dá)蛋白13個(gè)，不接受胚胎階段高表達(dá)蛋白7個(gè)(表1)。圖3顯示了其中部分差異表達(dá)蛋白的放大膠點(diǎn)圖。

圖1 生物素免疫組化染色后的小鼠內(nèi)膜組織學(xué)圖像(×200)A.經(jīng)生物素標(biāo)記后孕第1天小鼠子宮內(nèi)膜組織中的免疫染色； B. 經(jīng)生物素標(biāo)記后孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜組織中的免疫染色；C.對(duì)照組，未經(jīng)生物素標(biāo)記的小鼠子宮內(nèi)膜組織；LE.腔上皮；GE.腺上皮；SC.間質(zhì)細(xì)胞

圖2 孕第1天和第4天小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮表面蛋白二維電泳膠掃描圖小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮表面蛋白經(jīng)過(guò)抽提和純化后第一維用pH值3～10的IPG膠條進(jìn)行等電聚焦，第二維用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，膠進(jìn)行銀染顯色A.孕第1天;B.孕第4天

3.差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜分析：將二維電泳中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行切膠后提取純化，并進(jìn)行質(zhì)譜分析，差異表達(dá)超過(guò)3倍的蛋白質(zhì)，詳見表1。

4.部分差異表達(dá)蛋白的免疫組化染色:為了驗(yàn)證二維電泳發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白的結(jié)果，檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織的intergrin β1和AP-N的表達(dá)，筆者對(duì)孕第1天和孕第4天的小鼠子宮內(nèi)膜組織切片進(jìn)行免疫組化染色。intergrin β1在孕第1天小鼠子宮內(nèi)膜表面的表達(dá)明顯高于孕第4天小鼠(圖3A、B)，AP-N在孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜表面的表達(dá)明顯高于孕第1天小鼠(圖3C、D)，這些結(jié)果與二維電泳中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。

討 論

到目前為止，胚胎的滋養(yǎng)層是如何黏著于可接受胚胎狀態(tài)子宮內(nèi)膜并進(jìn)而完成著床尚不明確。近些年，一些比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究運(yùn)用于小鼠或人類子宮內(nèi)膜組織的著床相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)和研究[10, 21～24]。這些研究都是對(duì)子宮內(nèi)膜組織的全部細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。在筆者的研究中，集中發(fā)現(xiàn)了子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞表面蛋白的差異表達(dá)，這樣降低了其他蛋白的信息干擾，集中發(fā)現(xiàn)與胚胎黏著有關(guān)的蛋白。

表1 不接受胚胎階段及接受胚胎階段小鼠子宮內(nèi)膜表面差異蛋白列表

圖3 差異表達(dá)蛋白中intergrin β1和AP-N組織學(xué)圖像(×400)A.intergrin β1孕第1天小鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)； B.intergrin β1孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)；C. AP-N孕第1天小鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)；D. AP-N孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá);LE.腔上皮；GE.腺上皮；SC.間質(zhì)細(xì)胞

為了發(fā)現(xiàn)和胚胎黏著相關(guān)的蛋白，選取接受胚胎階段和不接受胚胎階段的內(nèi)膜的子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較。其中的表面蛋白用生物素進(jìn)行了標(biāo)記。而且這種標(biāo)記是不可穿透性的。只有細(xì)胞表面的蛋白才會(huì)被標(biāo)記，并且用免疫染色進(jìn)行了確認(rèn)，在圖1A和B的子宮內(nèi)膜表面可以見到一層標(biāo)志物生物素的染色。對(duì)于生物素的濃度和作用時(shí)間都進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)(這部分?jǐn)?shù)據(jù)沒有展示)。筆者發(fā)現(xiàn)30min的標(biāo)記時(shí)間和0.25mg/ml 的生物素濃度可以得到最佳的效果。因?yàn)槿绻眠^(guò)大的生物素濃度或者過(guò)長(zhǎng)的標(biāo)記時(shí)間都會(huì)見到內(nèi)膜間質(zhì)部出現(xiàn)生物素的蹤跡。一般4～5只小鼠的標(biāo)記蛋白足夠用于一個(gè)樣本的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)過(guò)抽提純化后的蛋白通過(guò)二維電泳進(jìn)行分離比較。經(jīng)過(guò)ImageMaster軟件的分析，筆者發(fā)現(xiàn)了在接受胚胎階段有12個(gè)蛋白高表達(dá)，在不接受胚胎階段有7個(gè)蛋白高表達(dá)(均>2倍的表達(dá)水平)。初步看來(lái)蛋白酶活性抑制劑相關(guān)蛋白表達(dá)升高，可能與滋養(yǎng)細(xì)胞侵入階段溶解相關(guān)細(xì)胞有關(guān)。因?yàn)樽甜B(yǎng)細(xì)胞侵入和腫瘤的浸潤(rùn)不完全相同，滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入需要調(diào)控侵入時(shí)溶解細(xì)胞的數(shù)量和深度有關(guān)。因?yàn)?，沒有控制的滋養(yǎng)細(xì)胞侵入和胎盤植入有相關(guān)性。這方面的蛋白在孕期豬的子宮內(nèi)膜也有明顯表達(dá)。kininogen-1是硫基蛋白酶抑制劑，此蛋白酶在人類胚胎著床中功能激活[13]。類似的alpha-1-antitrypsin 1-2也是分泌性蛋白酶抑制劑，在水牛的早期胚胎著床階段有高表達(dá)[4]。alpha-2-macroglobulin是一個(gè)廣譜的蛋白酶抑制劑，和小鼠胚胎著床前定位有關(guān)[25]。在差異表達(dá)的蛋白中，已經(jīng)有研究報(bào)道過(guò)vitronectin和胚胎著床的有關(guān)，它是integrin αvβ3的配體，后者是囊胚黏著階段的重要相關(guān)蛋白，也是內(nèi)膜容受性的重要標(biāo)記[15]。在小鼠著床中，如果integrin受體被阻斷，著床點(diǎn)的數(shù)量會(huì)顯著減少[26]。Annexin A2也是曾經(jīng)報(bào)道過(guò)的胚胎著床相關(guān)蛋白，在人類子宮內(nèi)膜中，annexin A2在內(nèi)膜接受胚胎著床期高表達(dá)而在接受胚胎著床的前期為低表達(dá)；這些結(jié)果說(shuō)明annexin A2在胚胎著床中有相關(guān)的功能作用[14]。近年來(lái)，annexin A2在生殖領(lǐng)域的研究在不斷深入。目前發(fā)現(xiàn)，annexin A2在胚胎著床中的作用是通過(guò)RhoA的激活和蛋白的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生的[27]。

在不接受胚胎的階段發(fā)現(xiàn)的高表達(dá)蛋白中,很多都是與免疫活性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。其中有些蛋白如mucin-4和spectrin beta-chain在異位妊娠女性的子宮內(nèi)膜中有高表達(dá)[17]。mucin-4是mucin家族中的一員，是細(xì)胞黏附的抑制劑，它在子宮內(nèi)膜上皮表面的缺失是囊胚黏著的重要前提[28]。而且mucin-4的表達(dá)下調(diào)是受到性激素調(diào)控的[29]。其他蛋白在此階段的表達(dá)已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)。例如，collagen alpha-1 (Ⅵ) chain在胚胎著床前和著床后均有高表達(dá)。

綜上所述，筆者通過(guò)生物素標(biāo)記小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮表面，并聯(lián)合二維電泳發(fā)現(xiàn)了一些在接受胚胎著床階段和不接受胚胎階段差異表達(dá)的表面蛋白，并發(fā)現(xiàn)了一些和胚胎著床相關(guān)的重要蛋白。