樊 倩， 王新磊， 鄭福平,*， 李賀賀， 孫寶國，張煜行， 張福艷

(1.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室， 北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100048；3.河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司， 河北 衡水 053000)

白酒是中國的國酒，是世界六大蒸餾酒之一[1]。白酒中有98%的乙醇水溶液及2%的微量成分，微量成分的差異構(gòu)成了不同白酒的獨特香氣與口感[2-3]。老白干香型白酒以衡水老白干白酒為代表，其香醇的口感、清雅的香氣，深受消費者喜愛[4]。有研究采用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)結(jié)合氣相色譜- 嗅聞(gas chromatography-olfactometry, GC-O)分析了老白干白酒，鑒定出了4-乙基愈創(chuàng)木酚、乙酸2-苯乙酯、丁酸、3-甲基丁醇、β-苯乙醇、2-乙?；?5-甲基呋喃、苯丙酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、3-甲基丁酸、香蘭素、乙酸乙酯、1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷和2,2-二乙氧基乙基苯等風(fēng)味成分對香氣貢獻較大[5]。王敏等[6]采用頂空固相微萃取(head space solid phase microextraction, HS-SPME)和GC-MS在老白干香型白酒中分析鑒定出了101種香氣成分，首次鑒定出大馬士酮、里那醇。Du等[7]分析比較了HS-SPME不同萃取纖維提取老白干香型白酒的效率，結(jié)果顯示50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維較適合。

全二維氣相色譜- 飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, GC×GC-TOF/MS)能夠有效地解決一維GC-MS低靈敏度、低分辨率的問題[8-9]，更有利于揮發(fā)性風(fēng)味化合物的分離鑒定。目前GC×GC-TOF/MS技術(shù)已經(jīng)被用于對醬香型[10-11]、濃香型[12-13]、清香型[14]、芝麻香型[15]白酒中揮發(fā)性組分的分析，極大地提高了白酒的分析檢測水平。白酒的不同釀制工藝對其風(fēng)味口感會有一定的影響[16-17]，傳統(tǒng)老白干香型白酒釀制工藝分為混蒸混燒老五甑和清蒸清燒三排凈2種工藝[18-19]，其區(qū)別主要為混蒸混燒老五甑工藝是將發(fā)酵好的酒醅與高粱同時蒸料蒸酒，清蒸清燒三排凈工藝是將酒醅與高粱分別蒸料和蒸酒，而對于這2種工藝釀制的白酒風(fēng)味物質(zhì)組成差異尚不清楚。為此，本研究采用HS-SPME結(jié)合GC×GC-TOF/MS技術(shù)分析比較2種不同工藝老白干香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味成分，研究結(jié)果為進一步探究不同釀制工藝對于老白干香型白酒風(fēng)味形成機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老白干香型混蒸混燒老五甑工藝原酒，發(fā)酵期24 d，酒精度68%；老白干香型清蒸清燒三排凈工藝原酒，發(fā)酵期27 d，酒精度66%。樣品均為河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，原酒酒精度測定按照GB/T 10345—2007 白酒分析方法[20]，以酒精計測得。

氯化鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。無水乙醇，色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。C6～C30正構(gòu)烷烴混合物，丙酸辛酯，色譜純，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。甲酸乙酯、乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丙烯酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、丙酸丙酯、2-甲基丁酸乙酯、甲酸異戊酯、異戊酸乙酯、異丁酸異丁酯、丁酸丙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丙酸丁酯、己酸甲酯、己酸乙酯、乙酸己酯、己酸丙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、己酸異丁酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、己酸異戊酯、乙酸辛酯、壬酸乙酯、辛酸異丁酯、乙酸壬酯、癸酸甲酯、己酸己酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、琥珀酸二乙酯、癸酸丙酯、十一酸乙酯、癸酸異丁酯、苯乙酸乙酯、水楊酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、苯丙酸乙酯、乙醛、3-甲基丁醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-丁醇、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-己醇、1-戊醇、1-己醇、3-辛醇、2-壬醇、1-辛醇、1-壬醇、1-癸醇、苯乙醇、乙酸、己酸、癸酸、2-庚酮、3-羥基-2-丁酮、3-乙?；?2-丁酮、2-十一烷酮、香葉基丙酮、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2-丁基呋喃、2-戊基呋喃、乙縮醛、2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、二甲基三硫，均為色譜純，北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC×GC-TOF/MS系統(tǒng)包括Agilent 7890B型氣相色譜儀(美國Agilent公司)，配置第二柱溫箱(適應(yīng)第二維色譜柱的溫度變化)、四噴口液氮型調(diào)制器及Pegasus 4D型飛行時間質(zhì)譜儀(美國LECO公司)。

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，固相微萃取手動進樣器，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品前處理

頂空固相微萃取法。分別采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取2種原酒中的揮發(fā)性成分。吸取老五甑工藝原酒樣品2.27 mL放入40 mL的頂空樣品瓶中，加入超純水12.73 mL稀釋至酒精度10% vol。吸取三排凈工藝原酒樣品2.21 mL放入另一40 mL的頂空樣品瓶中，加入煮沸的超純水12.79 mL稀釋至酒精度10% vol。分別加入10 μL質(zhì)量濃度為229.00 mg/L的內(nèi)標物丙酸辛酯(溶劑為無水乙醇)，并加入一定量的氯化鈉至飽和。分別在45 ℃的恒溫水浴中平衡20 min，插入已經(jīng)在250 ℃下老化10 min的萃取頭，在45 ℃的恒溫水浴中萃取40 min。萃取結(jié)束后，將萃取頭放在GC×GC進樣口熱解析5 min，進行GC×GC-TOF/MS分析。每種原酒樣品配制3個平行樣，分別萃取進樣分析。數(shù)據(jù)結(jié)果取3個平行樣的平均值。

1.3.2儀器分析條件

二維氣相色譜系統(tǒng)。第一維柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，第二維柱DB-5 (1.64 m×0.1 mm×0.1 μm)，均購于美國Agilent公司，兩根色譜柱通過毛細管柱連接器以串聯(lián)方式連接。載氣He，純度99.999%，流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；壓強30 PSI (206.85 kPa)；不分流手動進樣；主柱溫箱升溫程序：初始溫度45 ℃，以3 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；第二柱溫箱升溫程序：高于主柱溫箱5 ℃。調(diào)制器溫度：高于主柱溫箱15 ℃。調(diào)制周期6 s；冷吹時間700 ms，冷脈沖是干燥氮氣經(jīng)過液氮冷卻后由調(diào)制器調(diào)制形成。

質(zhì)譜分析條件。電子轟擊(election ionization,EI)離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，檢測器電壓-1 400 V，質(zhì)量掃描范圍35～400 u，采集頻率100 Hz。

1.4 定性分析方法

GC×GC-TOF/MS檢測的總離子流圖采用LECO Chroma TOF version 4D軟件處理數(shù)據(jù)，并采用NIST14譜庫檢索，選取匹配度在800以上的化合物，剔除沒有風(fēng)味貢獻的可疑化合物和柱流失物質(zhì)。

在相同GC×GC-TOF/MS條件下進樣C6～C30正構(gòu)烷烴混合物，將組分保留指數(shù)(retention index, RI)與文獻RI對比，取絕對值相差10以內(nèi)的化合物。

在相同GC×GC-TOF/MS條件下進樣83種化合物標準品，通過與未知化合物的保留時間和質(zhì)譜圖對比進行標準品定性，一維保留時間相同，二維保留時間相差0.5 s以內(nèi)。

1.5 定量分析方法

原酒中各揮發(fā)性化合物的含量是通過在稀釋后的萃取液中加入10 μL質(zhì)量濃度為229.00 mg/L的內(nèi)標物丙酸辛酯(溶劑為無水乙醇)進行內(nèi)標法定量，按式(1)計算各揮發(fā)性成分的含量。

(1)

式(1)中，ρi為揮發(fā)性化合物在原酒中的質(zhì)量濃度，μg/L；Ai為化合物的峰面積；A0為內(nèi)標物的峰面積；ρ0為內(nèi)標物在稀釋后的萃取液中的質(zhì)量濃度，μg/L；m為酒樣稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC×GC-TOF/MS分析結(jié)果

混蒸混燒老五甑工藝和清蒸清燒三排凈工藝2種老白干香型原酒揮發(fā)性成分的GC×GC-TOF/MS總離子流圖見圖1，圖中每個斑點代表一種化合物，通過NIST14譜庫檢索分別得到1 440個和1 628個色譜峰，經(jīng)扣除柱流失，合并相同峰，選取匹配度大于800的化合物并采用保留指數(shù)進一步定性，最終2種生產(chǎn)工藝分別得到234種和253種揮發(fā)性成分(見表1)。通過與標準品的保留時間和質(zhì)譜圖對比，對其中的83種化合物做了進一步結(jié)構(gòu)確認。

圖1 2種工藝老白干原酒揮發(fā)性成分的GC×GC-TOF/MS總離子流圖Fig.1 GC×GC-TOF/MS image of total ion chromatogram of volatiles in Laobaigan base Baijiu from two kinds of processes

由圖1可以看出，全二維氣相色譜有效地解決了傳統(tǒng)一維氣相色譜常見的化合物共流出現(xiàn)象，使一維共流出化合物在第二維色譜柱上得到了分離。如表1所示，乙酸乙酯和乙縮醛的一維時間均為406 s，應(yīng)用二維氣相色譜成功將其分離，這2種化合物分別呈菠蘿味和水果香，對老白干的水果香氣均具有一定的貢獻；壬酸乙酯和(E)-2-壬烯醛的一維時間均為1 827 s，分別呈水果香玫瑰香和黃瓜味青草香；辛酸異戊酯和1-壬醇分別呈水果香和青草香，其一維時間均為2 121 s；除此之外，還有2-壬醇和苯甲醛(1 785 s)、庚醛和2-庚酮(931 s)、2-壬酮和壬醛(1 540 s)、香葉基丙酮和2-甲氧基苯酚(2 527 s)等，均在二維上得到了很好的分離。

2.2 2種工藝老白干原酒揮發(fā)性成分分析結(jié)果

這2種原酒同屬于老白干香型，因此具有絕大多數(shù)的共有組分，但是由2種不同的釀造工藝釀制而成，因此揮發(fā)性成分在數(shù)量及含量上的不同，對整體風(fēng)味的貢獻有所差異。如表1，采用強極性柱(DB-Wax)為第一維色譜柱，弱極性柱(DB-5)為第二維色譜柱進行GC×GC-TOF/MS分析，在老五甑工藝原酒中鑒定出234種揮發(fā)性成分，包括85種酯類、33種醛類、38種醇類、9種酸類、30種酮類、4種酚類、5種醚類、8種呋喃類、9種縮醛類、8種含氮類、10種含硫類、2種內(nèi)酯類和3種萜烯類揮發(fā)性風(fēng)味化合物。在三排凈工藝原酒中鑒定出253種揮發(fā)性成分，包括83種酯類、34種醛類、42種醇類、11種酸類、27種酮類、5種酚類、7種醚類、8種呋喃類、11種縮醛類、8種含氮類、6種含硫類、3種內(nèi)酯類和8種萜烯類揮發(fā)性風(fēng)味化合物。2種工藝老白干原酒中共鑒定出273種化合物，有214種化合物為2種工藝老白干原酒共有，這些共有的化合物主要為酯類、醛類、醇類以及酮類化合物，它們賦予了老白干香型白酒香氣清雅，酒體醇厚細膩的整體風(fēng)格[21]。

2種工藝老白干原酒中酯類化合物檢測到的數(shù)量最多(85種)且含量最高，這一結(jié)果與其他香型白酒結(jié)論相一致[10,15,22]。2種工藝老白干原酒中含量均較高(≥55.23 mg/L)的為乳酸乙酯，其次是乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯。酯類化合物使老白干香型白酒呈現(xiàn)出以乳酸乙酯和乙酸乙酯為主體的酯香氣[21]。比較2種工藝老白干原酒，酯類化合物的總含量(圖2)在三排凈工藝原酒中(2.08 g/L)約為老五甑工藝原酒(1.60 g/L)的1.30倍。如圖1所示黑色曲線區(qū)域內(nèi)的大多數(shù)酯類化合物，在三排凈工藝原酒中含量大于老五甑工藝原酒，賦予三排凈工藝原酒更明顯的甜香、花香和果香，酒體口感比較純凈清雅，可能由于三排凈工藝發(fā)酵周期比老五甑工藝長，而酯類化合物主要是通過酵母和其他微生物發(fā)酵形成[23-24]。辛酸甲酯(橘子香)、異戊酸乙酯和己酸丙酯(水果香)在三排凈工藝原酒中含量高于老五甑工藝原酒達10倍以上；乙酸癸酯(橘子香)和棕櫚酸乙酯(奶油香)只在三排凈工藝原酒中檢測到且含量較高(≥4.69 mg/L)。

在2種工藝老白干原酒中還檢測到較多的醛類化合物(35種)、醇類化合物(44種)以及酮類化合物(35種)。白酒中的醛類化合物主要呈現(xiàn)青草香、麥芽香[25]。醛類化合物中含量較高的(≥22.36 mg/L)為糠醛(杏仁香)、苯乙醛(玫瑰香)和乙醛(青草香)。其中，乙醛被認為是協(xié)調(diào)老白干香型白酒風(fēng)味的重要化合物[19]。由圖2可見，對比2種工藝原酒，在醛類化合物的總含量上，老五甑工藝原酒(0.26 g/L)約為三排凈工藝原酒(0.16 g/L)的1.64倍，使得老五甑工藝原酒的青香、麥芽香、堅果香更為突出，可能由于三排凈工藝采用熱水潤料、清蒸原輔料，損失了部分醛類化合物的前體物質(zhì)。其中，3-糠醛(杏仁香)、(E,E)-2,4-庚二烯醛(堅果香)、(E)-2-壬烯醛(青草香)以及藏紅花醛(甜香)在老五甑工藝原酒中含量均高出三排凈工藝原酒7倍以上，賦予老五甑工藝原酒更豐富的香氣。

含量較高的醇類化合物(≥15.75 mg/L)為3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丙醇，主要呈現(xiàn)水果香、麥芽香、醇香。在三排凈工藝原酒中醇類總量(227.62 mg/L)約為老五甑工藝原酒(178.57 mg/L)的1.27倍，使得三排凈工藝原酒中水果香、醇香更為突出。對于酮類化合物，含量較高的(≥12.93 mg/L)為2-十一烷酮(水果香)、3-乙?；?2-丁酮(甜香)以及香葉基丙酮(青草香)。在三排凈工藝原酒中酮類化合物的含量(103.86 mg/L)略高于老五甑工藝原酒(94.55 mg/L)。其中，2-丁醇(醇香)、6-甲基-2-庚酮(樟腦香)、3-羥基-2-丁酮(奶油香)和2,2,6-三甲基環(huán)己酮(蜂蜜香)在三排凈工藝原酒中的含量均高出老五甑工藝原酒的6倍以上。另外，β-大馬酮(≥6.25 mg/L)呈蘋果香、玫瑰香、蜂蜜味，具有極低的閾值(0.1 μg/L)，對白酒風(fēng)味具有較大的貢獻[26-27]。

酸類、酚類、醚類、呋喃類、縮醛類、含氮類、含硫類、內(nèi)酯類和萜烯類化合物檢測到的數(shù)量均較少(≤11種)；除縮醛類化合物(總量≥115.55 mg/L)外，其余上述各類化合物總量均較低。在縮醛類化合物中，乙縮醛含量較高(≥57.34 mg/L)，能夠增強酒體放香，使老白干酒體口感更醇厚豐滿，是白酒老熟的重要標志之一[21]。對比2種工藝老白干原酒，老五甑工藝原酒中含硫類化合物在數(shù)量上高于三排凈工藝原酒，三排凈工藝原酒中萜烯類化合物在數(shù)量上高于老五甑工藝原酒，其他類化合物數(shù)量差別不大。在各類化合物總量上(圖2)，老五甑工藝原酒的酚類、含氮類和含硫類化合物分別為三排凈工藝原酒的2.34倍、1.43倍和1.73倍，賦予酒體煙熏香、堅果香、烤香、硫味等香氣，使老五甑工藝原酒香氣更為豐富，酒體口感醇厚豐滿，可能由于老五甑工藝采用混蒸混燒、續(xù)茬發(fā)酵，將原輔料中的復(fù)雜香氣蒸入酒中。而在三排凈工藝原酒中呋喃類、內(nèi)酯類和萜烯類化合物分別為老五甑工藝原酒的1.31倍、1.65倍和1.57倍，使得三排凈工藝原酒中甜香、水果香更為突出。其中，4-甲基愈創(chuàng)木酚(煙熏香)、2,5-二甲基吡嗪(堅果香、烤香)、3-甲硫基丙醛(煮土豆)以及3-甲硫基丙酸乙酯(蒜香)[28]，這些香氣化合物在老五甑工藝原酒中含量更為較高；而2-丁基呋喃(水果香、甜香)、γ-癸內(nèi)酯(水果香)[29]、α-蒎烯(松木香)[15]，在三排凈工藝原酒中含量更高。

表1 2種工藝老白干原酒揮發(fā)性成分分析結(jié)果Tab.1 Results of volatile compounds in Laobaigan base Baijiu of two kinds of processes

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

MS為檢索NIST 14質(zhì)譜庫鑒定；RI為核對保留指數(shù)鑒定，文獻保留指數(shù)均來自NIST 14譜庫；S為標準品鑒定；“-”為未檢測到該化合物。

圖2 老白干老五甑和三排凈工藝原酒中各類揮發(fā)性成分的總量Fig.2 Total contents of various types of volatiles in Laobaigan base Baijiu fermented by Laowuzeng and Sanpaijing processes

3 結(jié) 論

應(yīng)用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜- 飛行時間質(zhì)譜從老白干混蒸混燒老五甑工藝與清蒸清燒三排凈工藝2種原酒中共鑒定出273種化合物，數(shù)量及含量均較高的為酯類、醛類、醇類和酮類化合物。對比2種工藝原酒，老五甑工藝原酒中醛類、酚類、含氮類以及含硫類化合物的含量較高，使得老五甑工藝原酒酒體更具青草香、麥芽香、煙熏香、烤香以及硫香，香氣更加飽滿；而在三排凈工藝原酒中酯類、醇類、呋喃類、內(nèi)酯類以及萜烯類化合物的含量較高，使得三排凈工藝原酒更具果香、花香、甜香，酒體香氣更為清雅。以上研究結(jié)果為進一步探究不同釀制工藝對老白干白酒風(fēng)味的形成提供理論依據(jù)。