葛倩雯， 金寶花， 傅小進， 顧志敏， 陳析豐， 馬伯軍

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2.浙江師范大學 圖文信息中心，浙江 金華 321004)

葉片是植物光合作用的主要器官，合適的葉形態(tài)會增加植物的受光面積，促進光合作用.在超級雜交稻株型模式中，袁隆平將水稻功能葉的形態(tài)歸結為“長、直、窄、厚、凹”，其中“凹”是指葉片內(nèi)卷.適度的內(nèi)卷葉有助于葉片保持直立，改善群體生長后期的受光條件，提高光透射率，提高水稻的產(chǎn)量[1].因此，研究植物的卷葉調(diào)控基因?qū)ψ魑锏纳a(chǎn)具有重要意義.

植物葉片卷曲的程度是受基因調(diào)控的，迄今在水稻中已經(jīng)克隆了13個卷葉調(diào)控基因[2].其中大部分基因通過影響泡狀細胞的大小及數(shù)量，參與葉片卷曲程度的調(diào)控，如RL14[3]，SRL1[4]，ADL1[5]，NAL7[6]，NRL1[7]，ROC5[8]，OsZHD1[9]，REL1[10]和ACL1[11]等.還有一部分基因通過影響維管束鞘延伸區(qū)和主脈薄壁細胞數(shù)量、維管束韌皮部的變化，導致葉片卷曲，如LC2[12]，CFL1[13]和SLL1[14]等.本研究從水稻誘變庫中篩選到一個典型的內(nèi)卷葉矮化突變體rld，并對該突變體進行表型分析和基因定位，結合氨基酸序列與蛋白結構分析確定該基因突變后引起卷葉突變表型的原因.為進一步研究水稻葉片發(fā)育的分子機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻rld卷葉矮化突變體是從秈稻(OryzasativaL. ssp.indica)品種鎮(zhèn)恢084的60Co-γ輻射誘變庫中篩選獲得.以rld卷葉矮化突變體為母本與粳稻(OryzaSativaL. spp.japonica)野生型品種日本晴雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代.5月份，水稻種子37 ℃催芽2 d，將種子均勻點播于苗床上，30 d后插秧，常規(guī)大田管理.以上材料均種植于浙江省金華市水稻大田.

1.2 卷葉性狀測定方法

在成熟期，測量劍葉葉片最寬處自然卷曲狀態(tài)下葉緣間距(Ln)和展開后最寬處葉緣間距(Lw)，計算葉片卷曲度LRI=(Lw-Ln)/Lw×100%.

1.3 葉片的石蠟切片觀察

采用王承林[15]的方法進行石蠟切片，取新鮮葉片，用FAA固定液體(V(福爾馬林)∶V(冰醋酸)∶V(70%乙醇)=1∶1∶18)固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，脫蠟、番紅、固綠染色，然后在顯微鏡下觀察、掃描成像.

1.4 卷葉矮化突變基因的遺傳分析

在成熟期，調(diào)查F1與F2群體的表型，統(tǒng)計F2群體中野生型和卷葉矮化突變型的單株數(shù)，采用χ2檢驗分析F2群體中野生型與卷葉矮化突變型植株的分離比.

1.5 卷葉矮化突變基因的連鎖分析

采用群分法[16]進行基因的連鎖分析.選取卷葉矮化突變體、野生型日本晴、F2群體中20株野生型單株和20株卷葉矮化突變型單株，采用Murray等[17]的方法分別提取葉片總DNA，并將20株野生型單株的DNA等量混合成野生池，將20株卷葉矮化突變型單株的DNA等量混合成突變池.用覆蓋水稻12條染色體的多態(tài)性SSR、Indel標記[18-19]對卷葉矮化突變體、野生型日本晴，雜交F2代野生池和突變池的DNA進行PCR擴增.PCR采用Taq PCR Master Mix試劑盒(南京博爾迪生物科技有限公司)，程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火(不同引物)30 s，72 ℃復性30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色后，在凝膠成像儀中掃描成像，篩選在野生池和突變池的PCR條帶之間具有多態(tài)的標記，進行目的基因的連鎖分析.

1.6 卷葉矮化突變基因的精細定位

在目的基因連鎖的染色體區(qū)段，尋找和設計更多的多態(tài)性SSR、Indel標記(見表1).

表1 基因定位所用Indel標記引物序列

擴大定位群體的數(shù)目，選取F2群體中所有的卷葉矮化突變型單株，采用Murray等[17]的方法分別提取葉片總DNA，用多態(tài)性分子標記按照1.5的PCR方法對每個單株進行分析，檢測目的基因與分子標記間的染色體重組率，將目的基因精細定位在2個緊密連鎖的標記之間.

1.7 候選基因的PCR擴增與測序

采用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase試劑盒(TaKaRa)，50.0 μLPCR體系為：10.0 μL 5×PrimeSTAR緩沖液，4.0 μL dNTP混合物，2.0 μL 10 μmol/L引物(見表2)，2.0 μL模板DNA，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA保真酶，31.5 μL無菌水.程序為：95 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃復性90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物委托生物技術公司進行測序.

表2 候選基因PCR擴增引物序列

2 結果與分析

2.1 卷葉矮化突變體rld的表型特征

在水稻正常生長條件下，從5葉期開始rld突變體的葉片沿主脈向內(nèi)卷曲成圓筒狀，之后葉片始終表現(xiàn)高度卷曲，在成熟期進行測量，自然卷曲狀態(tài)下葉緣間距為(3.96±0.82) cm，展開后最寬處葉緣間距為(9.83±1.74) cm，葉片的卷曲度為59.7%.與野生型對照品種鎮(zhèn)恢084相比，rld突變體植株明顯矮小，發(fā)育遲緩且葉色加深，穂小而稀疏，結實率非常低，籽粒發(fā)育不良、畸形(見圖1).

a:水稻成熟期的植株；b:葉片；c:穗；d：籽粒

葉片組織的石蠟切片觀察表明，rld突變體葉片泡狀細胞的結構、數(shù)目與野生型對照沒有明顯的差異，但是維管束間下表皮細胞的面積明顯大于野生型對照(見圖2).

a：野生型鎮(zhèn)恢084葉片橫切面；b：rld突變體葉片橫切面；c：圖a放大部分；d：圖b放大部分(箭頭表示突變細胞)

2.2 卷葉矮化突變體rld的遺傳分析

用rld突變體做母本，與野生型日本晴雜交，其F1代植株均為野生型.F1代自交后獲得F2群體，F(xiàn)2植株的葉片出現(xiàn)野生型和卷葉矮化突變型，一共2 887個單株，其中2 195株為野生型，692株為卷葉矮化突變型.經(jīng)過χ2檢驗，F(xiàn)2群體中野生型與卷葉矮化突變型的比例為3∶1(χ2=1.23；P<0.05)，符合孟德爾遺傳.該結果表明rld突變體卷葉矮化性狀由一個隱性單基因控制.

2.3 卷葉矮化基因的連鎖分析和精細定位

用水稻中已公布的300多個SSR、Indel標記對親本日本晴與rld突變體進行多態(tài)性分析，篩選到86個分布在12條染色體的多態(tài)SSR標記.采用群分法進行目的基因的連鎖分析，通過以上86個SSR標記對F2群體的野生型和突變型2個DNA混池進行分析，發(fā)現(xiàn)9號染色體上標記R9M20與目的基因存在明顯的連鎖.

利用R9M20標記及其兩側的多態(tài)標記，對F2群體中20株突變型單株進行分析，將目的基因初步定位在RM24134和RM24303標記之間(見圖3a).為了精細定位目的基因，在RM24134和RM24303標記之間篩選了7個SSR多態(tài)標記，并設計了5個Indel多態(tài)標記，對F2群體中卷葉矮化突變型單株進行分析，最終將rld基因精細定位在Indel2和Indel5標記之間，物理距離約為32.3 kb(見圖3b).

a:rld的初定位；b：rld的精細定位；c：候選基因及突變位置;

2.4 候選基因的預測與測序分析

根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/Oryza_sativa/location/)提供的基因注釋信息，在rld基因的32.3 kb定位區(qū)間內(nèi)含有3個候選基因，分別是LOC_Os09g23180，LOC_Os09g23190，LOC_Os09g23200.其中，LOC_Os09g23200基因為已克隆的卷葉基因RL9[20].通過設計引物和PCR擴增，本實驗對rld突變體及其野生型對照鎮(zhèn)恢084的LOC_Os09g23200基因進行了測序分析，發(fā)現(xiàn)在該基因第一個外顯子處，rld突變體比鎮(zhèn)恢084少了3個堿基(見圖3c)，并導致第181位的精氨酸丟失.

劃紅線區(qū)域代表GARP-DNA結合保守結構域；-表示缺失的氨基酸；.表示終止密碼子

2.5 候選基因的蛋白序列分析

根據(jù)氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)第181位的精氨酸位于該基因編碼的GARP-DNA結合功能保守結構域上(見圖4).通過swiss-model網(wǎng)站(https://www.swiss-model.expasy.org/)提供的蛋白質(zhì)3D結構模型和功能預測信息，將野生型編碼的RL9蛋白和突變體rld編碼的蛋白進行結構模型建立(見圖5a～5b)，顯示這一精氨酸的丟失，引起了蛋白質(zhì)的空間結構的變化.經(jīng)過不同物種間的同源氨基酸序列比對顯示，RL9與KAN家族成員有很高的同源性，結構組織分析顯示,KAN蛋白和RL9蛋白都具有高度保守的GARP結構域，在不同物種間，RL9基因編碼的第181位精氨酸同樣顯示高度保守(見圖6).

3 討 論

卷葉是一種重要的農(nóng)藝性狀，與光合作用和作物產(chǎn)量直接相關.直立的半卷水稻葉片導致增強的光捕獲能力和增加的葉綠素含量，因此，提高了光合效率和產(chǎn)量，葉片適度卷曲同樣可以減少蒸騰作用，提高植株在干旱條件下的忍耐性.對玉米、甘蔗和谷物高粱的研究表明，葉片維管束和葉肉細胞的排列與光合效率密切相關.本實驗室發(fā)現(xiàn)的卷葉矮化突變體rld所帶的卷葉基因在生產(chǎn)上具有一定的應用價值.

a：RL9基因編碼蛋白結構模型；b:rld編碼蛋白結構模型

圖5RL9及rld突變基因編碼蛋白的3D結構模型預測

劃紅線區(qū)域代表GARP-DNA結合保守結構域；箭頭處表示rld的突變位點

本文鑒定的卷葉矮化突變體rld，屬于內(nèi)卷，從五葉期開始始終表現(xiàn)高度卷曲，并且伴隨著葉色加深，結實率下降等表型，通過石蠟切片觀察到其維管束之間的下表皮葉肉細胞面積明顯增大泡狀化從而導致葉片發(fā)生內(nèi)卷.對rld突變體進行了基因精細定位和候選基因測序，表明該突變表型是由于RL9基因的第一個外顯子缺失了3個堿基，這3個堿基編碼該基因上的第181位的精氨酸.RL9基因是水稻的轉(zhuǎn)錄因子，編碼一個SHAQKYF類MYB轉(zhuǎn)錄因子，屬于KANADI家族，該轉(zhuǎn)錄因子包含一個GARP結構域，其是高度保守螺旋-環(huán)-螺旋DNA結合結構域，研究表明，GARP結構域?qū)τ谡{(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄具有關鍵性作用[21]，KANADI家族中該GARP結構域的共有標識高于85%.RL9通過調(diào)控水稻葉片遠軸面厚壁組織細胞的程序化死亡來調(diào)控水稻葉片的形狀，該基因的突變導致遠軸面葉肉細胞程序性細胞死亡不能正常進行而抑制葉片內(nèi)卷的形成[14].在擬南芥中，KAN家族成員中功能突變的組合喪失導致遠軸同一性的逐漸喪失，kan1或者kan2單獨突變具有非常有限的或沒有形態(tài)學的改變，kan1kan2雙突變體明顯出現(xiàn)了葉片形態(tài)的改變，kan1kan2kan3三突變體更進一步增加了葉片的卷曲度且顯示更完全的軸向化[21].本研究中，發(fā)現(xiàn)rld突變體不僅影響葉片表型，而且導致畸形小穗，葉片顯示完全的內(nèi)卷，而在擬南芥中，kan1kan2kan3三突變體才顯示完全內(nèi)卷，表明KAN基因可能在水稻中發(fā)揮更大的作用.

通過氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，rld突變體由于缺失了一個精氨酸導致葉片出現(xiàn)高度內(nèi)卷，并且該氨基酸位于RL9蛋白的GARP-DNA結合保守結構域中，進一步的蛋白質(zhì)3D結構預測分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸的缺失導致RL9蛋白中GARP結構域蛋白空間結構形態(tài)發(fā)生改變，也導致GARP保守結構域功能改變，從而影響水稻葉片形態(tài)正常發(fā)育.通過不同物種間同源氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，RL9基因編碼的第181位的精氨酸在不同物種間一致高度保守，表明該氨基酸在RL9蛋白的正常功能行使過程中是必要的，對維持水稻葉片表型具有至關重要的作用.