馬 麗， 沈蔡慰， 陳 瑞， 吳玉環(huán)， 崔樂(lè)怡，陶 濤， 張婷婷， 朱葉心怡, 劉 鵬

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

0 引 言

栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)是中國(guó)廣泛種植的多年生攀援草本植物，從果實(shí)中提取的葫蘆素D可用于開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物，塊根可用于糖尿病的治療[1].鋁毒是制約全球酸性土壤地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，全世界約50%的潛在耕地因土壤酸化引起的鋁浸出而不能有效地發(fā)展為農(nóng)業(yè)耕地[2].植物的根長(zhǎng)及根系活力在鋁脅迫下受到抑制，可以作為衡量植株是否遭受毒害的特征[3].根是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中吸收營(yíng)養(yǎng)和水分的器官，通常會(huì)分泌一些物質(zhì)來(lái)幫助植株在逆境中更好地生存，這些物質(zhì)被統(tǒng)稱為根系分泌物，適量根系分泌物能夠去除或中和土壤中的有毒物質(zhì)，但分泌過(guò)多會(huì)產(chǎn)生自毒效應(yīng)，從而造成雙重脅迫[4].

細(xì)胞壁是植物細(xì)胞最外層的保護(hù)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁成分會(huì)隨著外界環(huán)境條件的變化發(fā)生調(diào)整，成為抵抗外界不利環(huán)境的屏障.Baldwin等[5]探究低溫脅迫下豌豆(PisumsativumL.)細(xì)胞壁代謝過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，果膠含量及其甲酯化程度在脅迫下增加，從而減輕低溫對(duì)植株的傷害.Fernandes等[6]采用紅外光譜技術(shù)分析葡萄(VitisviniferaL.)愈傷組織細(xì)胞壁化學(xué)成分在礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)脅迫下的變化，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的脅迫會(huì)使植物細(xì)胞壁官能團(tuán)的吸收峰發(fā)生明顯的位移.因此，細(xì)胞壁成分及官能團(tuán)變化對(duì)逆境下的植物來(lái)說(shuō)是一個(gè)重要指標(biāo).目前有關(guān)鋁脅迫與根系分泌物關(guān)系的探究主要側(cè)重于鋁毒對(duì)根系分泌物成分的改變[7]，而有關(guān)根系分泌物對(duì)鋁脅迫下栝樓根際生長(zhǎng)特性及細(xì)胞壁官能團(tuán)的影響仍未見(jiàn)報(bào)道.研究以2種耐鋁性有差異的栝樓為材料，通過(guò)解析根長(zhǎng)、生物量、根系活力及細(xì)胞壁紅外吸收光譜的變化，總結(jié)不同濃度根系分泌物對(duì)鋁脅迫下根生長(zhǎng)特性和細(xì)胞壁官能團(tuán)的影響，推動(dòng)鋁毒機(jī)理研究，同時(shí)尋找能夠有效緩解鋁脅迫的途徑，為栝樓在紅壤地區(qū)的大面積種植和推廣奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)室收集大量來(lái)自不同地區(qū)的栝樓種子，經(jīng)ISSR遺傳多樣性分析和鋁處理后篩選，得到親緣關(guān)系較遠(yuǎn)且耐鋁性差異較大的河北安國(guó)栝樓和浙江浦江栝樓作為實(shí)驗(yàn)材料[8]，其中河北安國(guó)栝樓耐鋁性較強(qiáng)，而浙江浦江栝樓對(duì)鋁敏感.

1.2 根系分泌物的收集

栝樓種子在砂床中萌發(fā)，選取長(zhǎng)勢(shì)良好且株高為15 cm的2種栝樓幼苗各40株，洗凈根部后分別置于盛有8 L蒸餾水的塑料桶中培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至500 mL，得到2種栝樓的根系分泌物置于-20 ℃冰箱中冷藏備用(根系分泌物成分可參考文獻(xiàn)[9]).

1.3 材料處理

另取同期萌發(fā)且株高為15 cm的2種栝樓幼苗各54株，轉(zhuǎn)移至裝有5 kg試樣土壤(紅壤，來(lái)自浙江師范大學(xué)生物園，風(fēng)干并磨碎過(guò)100目篩后使用)的塑料盆中，每盆3株，于恒溫25 ℃，濕度75%，光照16 h，黑暗8 h的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng).3 d后用AlCl3及根系分泌物對(duì)幼苗進(jìn)行處理，其中鋁處理設(shè)300，800 μmol/L 2個(gè)濃度，每盆添加AlCl3溶液50 mL，根系分泌物與鋁處理同時(shí)進(jìn)行，在鋁處理的基礎(chǔ)上設(shè)置4個(gè)處理組，分別添加根系分泌物0，20，30，60 mL，除上述8組外另設(shè)空白對(duì)照組CK，2種栝樓的9個(gè)處理組分別編號(hào)CK,Y300-0,Y300-20,Y300-30,Y300-60,Y800-0,Y800-20,Y800-30,Y800-60，每組6個(gè)重復(fù)，在處理7，14，21 d后，測(cè)定栝樓根部的各個(gè)生理指標(biāo).

1.4 生物量及根系活力的測(cè)定

將根剪下并洗凈，用吸水紙吸干根表面水分并用分析天平測(cè)得根鮮重?cái)?shù)據(jù)，隨后將根放入稱量瓶中，105 ℃烘干至恒重后稱量得到根干重[10].根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[11]：將根洗凈后，稱取0.3 g根尖置于試管中，加入0.4%TTC和H3PO4緩沖液(pH 7.5)各5 mL，37 ℃反應(yīng)3 h，加入2 mol/L硫酸2 mL終止反應(yīng)；將根取出并吸干水分，同3 mL乙酸乙酯及少量石英砂一起置于研缽中研磨，溶解后倒入10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯定容后靜置至完全沉淀，取濾液于485 nm處比色，記錄吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)含量.

1.5 細(xì)胞壁官能團(tuán)分析

剪取30個(gè)栝樓根尖，用0.5 mmol/L CaCl2清洗后蒸餾水洗滌2次，加入0.5 mL蒸餾水低溫下進(jìn)行研磨，研磨后10 000 r/min離心10 min，沉淀用1 mL 80%乙醇洗2次，用V甲醇/V氯仿=1/1混合溶液清洗一次，最后用1 mL丙酮清洗一次，沉淀進(jìn)行冷凍干燥后得到細(xì)胞壁[12].取1 mg細(xì)胞壁，采用NEXUS 670傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司)對(duì)細(xì)胞壁官能團(tuán)進(jìn)行分析.

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel 2010進(jìn)行整理，數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.用Origin 9.0軟件繪制紅外光譜圖，并用Omnic 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果分析

2.1 鋁脅迫下根系分泌物對(duì)栝樓根系活力及根生物量的影響

通過(guò)對(duì)比安國(guó)栝樓3個(gè)周期中CK組與Y300-0,Y800-0的根長(zhǎng)差異(見(jiàn)表1)，可以看到鋁處理抑制根的伸長(zhǎng)且高濃度鋁的作用效果更加顯著，7 d時(shí)Y300-0組最長(zhǎng)根長(zhǎng)為CK組的69.7%，Y800-0組則為CK的64.7%，14 d時(shí)Y300-0,Y800-0組的根長(zhǎng)分別為CK組的64.4%和46.6%，21 d時(shí)為57.0%和42.6%，因此鋁處理濃度與根伸長(zhǎng)的抑制程度正相關(guān).在添加根系分泌物后下安國(guó)栝樓的根長(zhǎng)增加，在30 mL時(shí)根長(zhǎng)達(dá)到最大值，但用量達(dá)到60 mL時(shí)根長(zhǎng)降至CK組以下，7 d時(shí)Y300-20組的最長(zhǎng)根長(zhǎng)為Y300-0的1.7倍，CK組的1.2倍，Y300-30組的最長(zhǎng)根長(zhǎng)則達(dá)到了Y300-0的2.2倍，CK組的1.5倍，Y300-60組的根長(zhǎng)則降至Y300-0的83.8%，CK組的58.5%，該結(jié)果表明，高濃度的根系分泌物并未對(duì)根長(zhǎng)起促進(jìn)作用，反而進(jìn)一步抑制了根的伸長(zhǎng).

從表1中可以發(fā)現(xiàn)，根鮮重與干重的比值始終維持在10倍左右，且安國(guó)栝樓根鮮重、干重變化趨勢(shì)與根長(zhǎng)趨勢(shì)一致，7 d時(shí)Y300-0組的根鮮重降至CK組的32.0%，Y300-20組的根鮮重為Y300-0的 3.3倍，CK組的1.1倍，Y300-30組的根鮮重為Y300-0的4.0倍，CK組的1.3倍，但Y300-60組的根鮮重卻降至Y300-0的1.8倍，CK組的57.2%，鮮重仍在30 mL根系分泌物施用時(shí)達(dá)到最大，在60 mL處降至CK以下.另外，安國(guó)栝樓根系活力的改變也符合這一趨勢(shì)，根中所測(cè)的各個(gè)指標(biāo)存在相關(guān)性，通過(guò)分析各指標(biāo)的變化趨勢(shì)，表明鋁脅迫下低濃度根系分泌物促進(jìn)栝樓根部生長(zhǎng)，高濃度根系分泌物抑制生長(zhǎng).

浦江栝樓4個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)與安國(guó)栝樓一致，但通過(guò)數(shù)據(jù)分析可確定二者的耐鋁性存在差異.浦江栝樓與安國(guó)栝樓CK組的長(zhǎng)勢(shì)在14 d時(shí)最為接近，此時(shí)安國(guó)栝樓Y300-0組的鮮重為CK的31.8%，浦江栝樓Y300-0組的鮮重為CK的33.1%，表明300 μmol/L鋁處理對(duì)2種栝樓的脅迫效果較為接近，但當(dāng)鋁處理濃度達(dá)到800 μmol/L時(shí)，安國(guó)栝樓Y800-0的鮮重為CK的36.8%，在浦江栝樓中卻達(dá)到了19.0%.因此，高濃度鋁脅迫對(duì)浦江栝樓的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于安國(guó)栝樓.

2.2 鋁脅迫下根系分泌物對(duì)栝樓根系細(xì)胞壁官能團(tuán)的影響

2.2.1 不同處理下栝樓細(xì)胞壁紅外光譜圖

圖1和圖2中4 000 cm-1～1 330 cm-1是官能團(tuán)區(qū)，1 330 cm-1～500 cm-1是指紋區(qū).官能團(tuán)區(qū)中3 285 cm-1左右較寬的吸收峰是-OH伸縮振動(dòng)峰，2 920 cm-1處是C-H伸縮振動(dòng)峰，1 640 cm-1附近的吸收峰是蛋白質(zhì)的C=O伸縮振動(dòng)峰(酰胺I帶)，1 438 cm-1處的吸收峰是苯環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)峰，1 340 cm-1處的吸收峰是油脂化合物-CH2的彎曲振動(dòng)峰.指紋區(qū)中1 240 cm-1附近是由蛋白質(zhì)C-N伸縮振動(dòng)和N-H的彎曲振動(dòng)疊加形成的酰胺Ⅲ帶，1 025 cm-1處的譜帶為多糖骨架R-O鍵的振動(dòng)吸收峰，690 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是N-H面外彎曲振動(dòng)峰.上述吸收峰的存在表明細(xì)胞壁中含有氨基酸、多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、飽和烴和芳香類物質(zhì)，圖1和圖2中浦江栝樓與安國(guó)栝樓的吸收峰種類相同，峰形相似，說(shuō)明2種栝樓的細(xì)胞壁成分和含量相近.各峰中吸光度最高的是多糖骨架R-O振動(dòng)吸收峰，該峰的峰強(qiáng)代表細(xì)胞壁中骨架多糖含量.因此，糖類是栝樓細(xì)胞壁最主要的組成物質(zhì).

表1 鋁脅迫下根系分泌物對(duì)栝樓根系活力及根部生物量的影響

注：表內(nèi)數(shù)字后字母表示不同處理差異(P<0.05).

鋁處理后，R-O振動(dòng)吸收峰和-OH伸縮振動(dòng)峰的吸光度變化最為顯著，其他吸收峰的強(qiáng)度并未發(fā)生明顯改變，2類吸收峰的強(qiáng)度在鋁處理后增強(qiáng)，但在根系分泌物添加后受到抑制.安國(guó)栝樓b,c,d,e組與a組的峰形基本一致，但f組的R-O振動(dòng)吸收峰和-OH伸縮振動(dòng)峰相比a組吸光度有明顯的升高，g,h,i組與f組相比峰強(qiáng)有所降低，其中h組峰形與a組最為接近.浦江栝樓對(duì)鋁處理更加敏感，2種栝樓a組的峰形相似，但浦江栝樓f,g,i組的R-O振動(dòng)吸收峰和-OH伸縮振動(dòng)峰的峰強(qiáng)明顯高于安國(guó)栝樓.以上結(jié)果表明，鋁處理使細(xì)胞壁多糖含量升高，并增加細(xì)胞壁上羥基的數(shù)量，根系分泌物能夠抑制鋁對(duì)細(xì)胞壁成分的改變，當(dāng)根系分泌物用量達(dá)到30 mL時(shí)效果最好.另外，浦江栝樓在鋁脅迫下紅外光譜的變化大于安國(guó)栝樓，表明浦江栝樓對(duì)鋁脅迫更加敏感.

2.2.2 不同處理下栝樓細(xì)胞壁官能團(tuán)及紅外吸收頻率

a:CK;b:Y300-0;c:Y300-20;d:Y300-30;e:Y300-60;f:Y800-0;g:Y800-20;h:Y800-30;i:Y800-60

a:CK;b:Y300-0;c:Y300-20;d:Y300-30;e:Y300-60;f:Y800-0;g:Y800-20;h:Y800-30;i:Y800-60

通過(guò)分析表2、表3中數(shù)據(jù)可知，2 920 cm-1處C-H伸縮振動(dòng)及1 640 cm-1處酰胺I帶的紅外吸收頻率不變，而其他官能團(tuán)在處理后吸收頻率發(fā)生明顯變化，因此，這2類官能團(tuán)與脅迫無(wú)關(guān).300 μmol/L鋁處理下，安國(guó)栝樓-OH伸縮振動(dòng)的吸收頻率基本不變，但當(dāng)鋁處理濃度達(dá)到800 μmol/L時(shí)，官能團(tuán)紅外吸收頻率由CK組的3 284 cm-1偏移至Y800-0組的3 328 cm-1處.數(shù)據(jù)表明,300 μmol/L鋁脅迫處理對(duì)該官能團(tuán)的影響并不顯著，但800 μmol/L鋁脅迫削弱了蛋白質(zhì)和碳水化合物之間的氫鍵.Y800-20,Y800-30和Y800-60組的紅外吸收頻率分別為3 279 cm-1，3 269 cm-1和3 299 cm-1，該結(jié)果表明，根系分泌物能夠緩解鋁脅迫對(duì)官能團(tuán)的損傷.表2中苯環(huán)骨架、-CH2對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰、酰胺Ⅲ帶和R-O振動(dòng)吸收峰有相同的變化趨勢(shì)，即紅外吸收僅出現(xiàn)在CK和Y300-302組當(dāng)中，這些官能團(tuán)的變化說(shuō)明，鋁處理破壞了安國(guó)栝樓細(xì)胞壁上芳香化合物、油脂、蛋白質(zhì)及多糖物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而30 mL根系分泌物最有效地緩解了300 μmol/L鋁處理對(duì)官能團(tuán)的損傷，但當(dāng)鋁處理濃度達(dá)到800 μmol/L時(shí)，官能團(tuán)受到的損傷不可逆.

2種栝樓除N-H面外彎曲的其他官能團(tuán)對(duì)鋁脅迫及根系分泌物的響應(yīng)方式基本相同，但-OH伸縮振動(dòng)的吸收頻率變化體現(xiàn)了2種栝樓的耐鋁性差異.在300 μmol/L鋁處理后，浦江栝樓-OH伸縮振動(dòng)峰的吸收頻率由CK組的3 286 cm-1偏移至3 320 cm-1處，而在安國(guó)栝樓中該吸收峰則由3 284 cm-1上移至3 288 cm-1，浦江栝樓-OH的偏移幅度更大.另外，浦江栝樓CK組-OH的紅外吸收頻率Y800-0,Y800-30組-OH伸縮振動(dòng)峰的吸收頻率分別為3 335 cm-1和3 333 cm-1，此時(shí)根系分泌物無(wú)法緩解-OH吸收頻率的改變，因此,浦江栝樓對(duì)鋁毒更加敏感.

表2 安國(guó)栝樓細(xì)胞壁官能團(tuán)及其對(duì)應(yīng)的紅外吸收頻率 cm-1

序號(hào)官能團(tuán)CKY300-0Y300-20Y300-30Y300-60Y800-0Y800-20Y800-30Y800-601-OH3 2843 2883 2893 2893 2773 3283 2793 2693 2992C-H2 9222 9212 9242 9242 9232 9222 9222 9232 9223C=O1 6371 6371 6371 6371 6371 6371 6331 6341 6404C==C1 473,1 438,1 4011 4381 4381 473,1 438,1 4021 4301 4211 4381 426-5-CH21 341--1 339-----6C-N,N-H1 239--1 236-----7R-O1 057,1 0271 0251 0251 056,1 0261 0291 0261 0261 0241 0268N-H690--668-----

表3 浦江栝樓細(xì)胞壁官能團(tuán)及其對(duì)應(yīng)的紅外吸收頻率 cm-1

序號(hào)官能團(tuán)CKY300-0Y300-20Y300-30Y300-60Y800-0Y800-20Y800-30Y800-601-OH3 2863 3203 3053 2873 2953 3353 3233 3333 3322C-H2 9212 9212 9252 9242 9232 9182 9222 9212 9203C=O1 6361 6411 6371 6351 6401 6371 6381 6371 6374C==C1 471,1 436,1 4011 4361 4381 471,1 436,1 4021 4331 4371 4251 4281 4325-CH21 378--1 375-----6C-N,N-H1 236--1 236-----7R-O1 054,1 0251 0311 0271 054,1 0271 0301 0281 0281 0271 0288N-H526-535-532-529528529

3 討 論

根長(zhǎng)及根系活力是植物在鋁毒環(huán)境中最敏感的2個(gè)指標(biāo)，而生物量的變化則是鋁毒害根部的進(jìn)一步表現(xiàn)[13].通過(guò)對(duì)上述生長(zhǎng)指標(biāo)的分析可知，栝樓生長(zhǎng)在鋁處理下受到抑制，但在根系分泌物添加后有不同程度的恢復(fù)，原因是鋁毒通過(guò)阻礙根尖細(xì)胞的分裂抑制了根的伸長(zhǎng)，而根系分泌物中的有機(jī)酸可與鋁離子螯合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而緩解鋁離子對(duì)植株造成的損傷[14].研究結(jié)果還體現(xiàn)了高濃度根系分泌物濃度對(duì)栝樓生長(zhǎng)的抑制作用，Kopittke等[15]在研究根系分泌物對(duì)大豆(Glycinemax)鋁脅迫的緩解機(jī)制時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)了根系分泌物低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象.此類現(xiàn)象的出現(xiàn)可歸因于根系分泌物中化感物質(zhì)導(dǎo)致的自毒效應(yīng)，根系分泌物除有機(jī)酸外還存在少量酚酸類物質(zhì)，如苯酚、苯甲醛、肉桂酸等，此類物質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)植株造成毒害[16]，即農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中出現(xiàn)的“連作障礙”，因此,如何避免根系分泌物誘導(dǎo)的自毒效應(yīng)是后續(xù)需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題.

植物細(xì)胞壁中富含果膠、纖維素和半纖維素等多糖，其中半纖維素和果膠是Al3+的結(jié)合部位[17].Zhu等[18]在水稻中的研究顯示，鋁毒促進(jìn)水稻(Oryzasativa)細(xì)胞壁半纖維素和果膠的合成，研究中2種栝樓的R-O振動(dòng)吸收峰在鋁處理下升高，證實(shí)了鋁毒對(duì)細(xì)胞壁多糖合成的誘導(dǎo)作用.該結(jié)果表明，鋁脅迫可通過(guò)改變細(xì)胞壁成分從而增加Al3+在細(xì)胞壁上的結(jié)合位點(diǎn)，從而加強(qiáng)對(duì)植株造成的脅迫效果.另外，紅外光譜中-OH伸縮振動(dòng)峰的峰強(qiáng)在鋁脅迫下提高，細(xì)胞壁上羥基的數(shù)目增多，Yang等[19]在研究鋁脅迫對(duì)水稻的作用時(shí)則發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫增強(qiáng)果膠甲酯酶的活性，使得半乳糖醛酸的甲酯鍵水解為羧基，羥基和羧基上的氧原子均可與Al3+結(jié)合，上述結(jié)果表明，鋁毒除改變細(xì)胞壁成分以外，還可通過(guò)修飾細(xì)胞壁物質(zhì)官能團(tuán)以增強(qiáng)細(xì)胞壁陽(yáng)離子交換能力，方便Al3+與細(xì)胞壁的結(jié)合，從而加重植株的鋁毒表型.根系分泌物添加后，R-O振動(dòng)吸收峰和-OH伸縮振動(dòng)峰的峰強(qiáng)減弱，說(shuō)明根系分泌物通過(guò)抑制鋁離子活性緩解鋁毒.

鋁處理下2種栝樓多個(gè)官能團(tuán)的紅外吸收頻率發(fā)生變化，張曉斌等[20]發(fā)現(xiàn)鳳眼蓮(Eichhorinacrassipes)根細(xì)胞壁上羥基的氧配體可與鎘離子結(jié)合，結(jié)合時(shí)-OH吸收峰向低頻位移，而本實(shí)驗(yàn)中鋁處理使-OH伸縮振動(dòng)峰向高頻位移.羥基紅外吸收頻率的偏移是由于-OH與Al3+的配位結(jié)合，當(dāng)羥基上的O配體與金屬離子結(jié)合時(shí)吸收頻率發(fā)生變化，而紅外吸收頻率偏移方向相反是由于2類金屬離子本身的性質(zhì)差異.另外，鋁處理使苯環(huán)骨架、-CH2對(duì)稱彎曲、酰胺Ⅲ帶及多糖骨架R-O鍵的吸收峰發(fā)生變化，說(shuō)明鋁處理可與細(xì)胞壁上芳香化合物、蛋白質(zhì)、油脂和多糖上的這些基團(tuán)發(fā)生交換或絡(luò)合，因此，后續(xù)研究可從上述幾類物質(zhì)入手探究鋁脅迫和細(xì)胞壁物質(zhì)的相互作用.