殷張昕， 高彤彤， 莊紫薇， 鐘曉宇， 李季穗，王文波， 姜科聲， 胡一中， 徐曉虹

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

0 引 言

BPA是酚類化合物中具有代表性的一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,因其可以改進(jìn)塑料制品的可塑性和拉伸性而大量應(yīng)用于生產(chǎn)碳酸聚酯、環(huán)氧樹脂類食品飲料包裝材料、醫(yī)療用品和日常用品,導(dǎo)致人們和野生動(dòng)物的終生BPA暴露風(fēng)險(xiǎn).2008年美國健康食品安全檢查報(bào)告調(diào)查2 517人中有92.6%的尿液檢出BPA,兒童和青少年體內(nèi)BPA含量更高[1].BPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似己烯雌酚,可與ER結(jié)合而表現(xiàn)出弱雌激素活性，從而干擾內(nèi)源性激素對(duì)機(jī)體生理活動(dòng)的調(diào)節(jié),對(duì)人類和野生動(dòng)物的生殖和發(fā)育產(chǎn)生危害[1-2].據(jù)此,歐美制定了人群BPA的最低容許攝入量為50 μg·kg-1·d-1.然而,近十多年的研究發(fā)現(xiàn),低劑量BPA(<50 μg·kg-1·d-1)可影響人和動(dòng)物的腦和行為發(fā)育[3-5].出生早期BPA暴露可引起雌性大鼠青春期提前[6],妊娠期BPA暴露加重青春期仔鼠的焦慮和抑郁樣狀態(tài)[7],并消除焦慮和抑郁行為的性別差異[8-9],還可影響腦內(nèi)神經(jīng)元突觸發(fā)育[10].

青春期是腦發(fā)育和社會(huì)認(rèn)知形成的關(guān)鍵時(shí)期,此時(shí)開始發(fā)育的性腺分泌性激素,對(duì)社會(huì)行為的神經(jīng)環(huán)路成熟和功能起激活作用,對(duì)社會(huì)行為的形成及其性別分化非常重要[11].社會(huì)玩耍是最早發(fā)生于非母親指向的幼年至青春期同種個(gè)體間的社會(huì)行為,有利于個(gè)體社會(huì)技能和認(rèn)知功能發(fā)育.早期社會(huì)隔離和玩耍剝奪會(huì)減少青少年社會(huì)動(dòng)機(jī),使成年后社會(huì)互作減少,攻擊行為增加,并影響性行為[12].社會(huì)行為異常還是早期精神發(fā)育障礙的主要癥狀,自閉癥和早發(fā)性精神分裂癥患者在兒童至青春期即表現(xiàn)出社會(huì)玩耍和社會(huì)互作減少[13].青春期性激素對(duì)社會(huì)行為神經(jīng)環(huán)路成熟和功能激活的重要作用,使青春期的腦對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物非常敏感[14].流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),出生前后BPA暴露導(dǎo)致兒童攻擊、注意缺陷、多動(dòng)障礙、焦慮和抑郁等多種精神和情緒異常[15].因此,推測青春期暴露于BPA很有可能影響雌性動(dòng)物的社會(huì)行為,但目前國內(nèi)外還沒有相關(guān)報(bào)道.本文探討了青春期BPA暴露對(duì)雌鼠情緒和社會(huì)行為的影響,并分析是否與DA遞質(zhì)系統(tǒng)活動(dòng)的改變有關(guān).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、模型制備與分組

3周齡ICR雌性小鼠購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心,常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)1周后,參考人群日常暴露水平,設(shè)3個(gè)BPA暴露組:0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1(根據(jù)體表面積藥理劑量換算相當(dāng)于人體暴露水平:3.24,32.4,324 μg·kg-1·d-1)和溶媒對(duì)照組(油).每天灌胃染毒BPA連續(xù)3周,制備青春期BPA暴露模型.每組小鼠分2籠飼養(yǎng).在8周齡(青年期)時(shí),每組隨機(jī)從各籠中取12只小鼠進(jìn)行行為檢測(n=12),另取未進(jìn)行行為測試的8只小鼠眼眶取血,酶聯(lián)免疫分析法檢測小鼠腦和血清雌二醇(estradiol,E2)水平(n=8),取6只小鼠提取腦紋狀體組織用于蛋白表達(dá)檢測(n=6),最后分離子宮稱重,計(jì)算子宮系數(shù)(子宮質(zhì)量/體質(zhì)量).

1.2 行為測試

行為測試按以下順序進(jìn)行.整個(gè)過程用小動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(德國TSE 系統(tǒng)股份有限公司)記錄.每一行為結(jié)束后,隔天進(jìn)行下一個(gè)行為檢測.每只小鼠測試后用75%乙醇擦拭模型,防止氣味影響下一個(gè)動(dòng)物的行為.所有行為由小動(dòng)物行為分析系統(tǒng)自動(dòng)監(jiān)測記錄,并由經(jīng)過訓(xùn)練的人員采用雙盲法采集和分析數(shù)據(jù).

采用曠場行為[16]記錄小鼠5 min內(nèi)的跑動(dòng)穿越格數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、站立和理毛次數(shù)(n=12).其中,跑動(dòng)格數(shù)反映動(dòng)物在新異環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng)性,站立次數(shù)反映動(dòng)物的探究意愿,中央?yún)^(qū)停留時(shí)間反映焦慮狀態(tài).

采用社會(huì)玩耍行為[16]記錄15 min內(nèi)2只相同年齡和處理的陌生小鼠互相爬跨、追逐、打斗、理毛和嗅探等玩耍指標(biāo),其中互相理毛和嗅探作為社會(huì)探索(n=12)[17].

采用三室模型[16]記錄5 min內(nèi)待測小鼠分別在含陌生鼠圓筒或含空?qǐng)A筒的隔間所停留時(shí)間，以及對(duì)陌生鼠或空?qǐng)A筒的嗅探時(shí)間來檢測小鼠的社會(huì)交互能力(n=12).測試小鼠在含陌生鼠隔間停留或嗅探陌生鼠的時(shí)間越長,社會(huì)交互能力越強(qiáng)[18].

采用高架十字迷宮[16]記錄5 min內(nèi)動(dòng)物在開放臂的停留時(shí)間來評(píng)價(jià)焦慮情緒,中央?yún)^(qū)探頭次數(shù)反映動(dòng)物的探究意愿(n=12).

采用強(qiáng)迫游泳模型[16]檢測動(dòng)物的習(xí)得性無助而評(píng)價(jià)其抑郁狀態(tài)[19].記錄小鼠從游泳開始至出現(xiàn)第1次靜止不動(dòng)的時(shí)間記為潛伏期;記錄6 min強(qiáng)迫游泳期的后4 min內(nèi)小鼠靜止不動(dòng)的總時(shí)間.靜止不動(dòng)的潛伏期越短或靜止不動(dòng)總時(shí)間越長表示抑郁越嚴(yán)重(n=12).

1.3 Western Blot檢測紋狀體組織ERβ，DAT和 DR1蛋白表達(dá)水平

小鼠(8周齡)斷頸處死后取腦,4 ℃分離雙側(cè)紋狀體組織,制備蛋白樣品分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆?n=6).取10～20 μL蛋白樣品SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)上,封閉,分別加相應(yīng)一抗(β-actin(1∶1 000),ER-β(1∶400),DAT(1∶500),DR1(1∶600))孵育,漂洗,再將NC膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育,漂洗,用免疫化學(xué)發(fā)光試劑顯色,X片曝光后顯影、掃描,Quantity One軟件半定量分析蛋白條帶光密度.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(M±SE)表示,采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件通過單因素方差分析不同劑量BPA暴露的作用,進(jìn)行Post-hoc 測試后LSD檢驗(yàn),P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 青春期BPA暴露對(duì)雌鼠生長發(fā)育的影響

青春期0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露沒有明顯改變青年雌鼠體質(zhì)量和子宮系數(shù),提示青春期低劑量BPA暴露對(duì)小鼠的生長和生殖器官發(fā)育沒有明顯影響(見表1).

表1 BPA對(duì)雌鼠體質(zhì)量和子宮系數(shù)的影響

2.2 青春期BPA暴露對(duì)雌鼠曠場行為的影響

4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠在曠場中懸空站立次數(shù)(P<0.05),0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠在中央?yún)^(qū)的停留時(shí)間(P<0.05),提示青春期BPA暴露顯著降低小鼠的探究意愿,并提高其焦慮狀態(tài)(見表2).

表2 青年雌鼠的曠場行為(n=12)

注：與對(duì)照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05).

2.3 青春期BPA暴露對(duì)雌鼠高架十字迷宮和強(qiáng)迫游泳行為的影響

高架十字迷宮行為測試結(jié)果顯示,青春期0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露顯著縮短小鼠在開放臂的停留時(shí)間(P<0.01,P<0.05),延長其在封閉臂的停留時(shí)間(P<0.05),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠中央?yún)^(qū)探頭次數(shù)(均為P<0.05)(見表3).強(qiáng)迫游泳測試結(jié)果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著了縮短小鼠強(qiáng)迫游泳時(shí)第1次靜止不動(dòng)的潛伏期(P<0.05)和增加了靜止不動(dòng)的總時(shí)間(P<0.05)(見圖1a～b),提示青春期BPA暴露加重雌鼠的焦慮和抑郁樣情緒,降低了其探究的意愿.

表3 青年雌鼠的高架十字迷宮行為(n=12)

注：與對(duì)照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01).

2.4 青春期BPA暴露對(duì)雌鼠社會(huì)玩耍和社會(huì)交互能力的影響

社會(huì)玩耍行為測試中,青春期0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露顯著減少小鼠的社會(huì)玩耍時(shí)間(P<0.05),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少社會(huì)探索時(shí)間(P<0.05,P<0.01)和探索頻率(4.00 mg·kg-1·d-1BPA，P<0.01);三室模型檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,BPA暴露雖然沒有明顯改變小鼠對(duì)陌生鼠或空?qǐng)A筒的嗅探時(shí)間,但0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著降低了小鼠嗅探陌生鼠和嗅探空?qǐng)A筒的時(shí)間比(P<0.05),提示青春期BPA暴露不僅顯著降低小鼠的社會(huì)玩耍能力,還減弱其社會(huì)探究意愿和社會(huì)交互能力(見表4).

表4 青年雌鼠的社會(huì)玩耍和社會(huì)交互能力(n=12)

注：與對(duì)照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01).

2.5 青春期BPA暴露對(duì)成年雌鼠紋狀體DAT和DR1表達(dá)的影響

鑒于紋狀體的DA遞質(zhì)系統(tǒng)在情緒和社會(huì)行為中的關(guān)鍵作用,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了紋狀體DA轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)和DA的D1受體(DR1)蛋白表達(dá)水平.研究結(jié)果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著上調(diào)DA轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)的表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著上調(diào)DR1的表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)(見圖2a～b).

與對(duì)照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01)

2.6 青春期BPA暴露對(duì)青年雌鼠腦和血清雌激素水平以及紋狀體ERβ表達(dá)的影響

由于雌激素通過腦內(nèi)雌激素受體參與調(diào)節(jié)情緒和社會(huì)行為,而紋狀體又與情緒和社會(huì)行為密切相關(guān),實(shí)驗(yàn)檢測了腦和血清的雌二醇水平,并用Western Blot分析了紋狀體ERβ蛋白表達(dá).研究結(jié)果顯示,青春期0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露沒有明顯改變青年雌鼠腦和血清雌二醇水平(見圖3a～b),但0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著下調(diào)紋狀體ERβ表達(dá)水平(P<0.01)(見圖3c).

與對(duì)照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01)

3 討 論

青春期作為兒童到成年的一個(gè)過渡期,性腺開始發(fā)育,此時(shí)分泌的性激素對(duì)腦和行為發(fā)育至關(guān)重要.有人認(rèn)為在出生前后,腦內(nèi)性激素主要調(diào)控行為相關(guān)神經(jīng)環(huán)路的形成;而在青春期,性激素對(duì)這些環(huán)路的成熟和功能起激活作用,是腦和行為發(fā)育的第2個(gè)關(guān)鍵期[11].因此,青春期的腦對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物很敏感.在動(dòng)物的一生中,最早非母親指向的社會(huì)行為發(fā)生在幼年至青春期個(gè)體間的玩耍.社會(huì)玩耍從社會(huì)探究開始,表現(xiàn)為2只陌生小鼠通過相互嗅探熟悉對(duì)方,進(jìn)行追逐、打斗、理毛和爬跨等玩?；顒?dòng),是社會(huì)交互的一種形式,也是個(gè)體融入社會(huì)的開始[17-18],對(duì)動(dòng)物的生存和成年后的繁殖至關(guān)重要.

近年來動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn),宮內(nèi)暴露于BPA的青春期獼猴和小鼠與同性同伴的社會(huì)互動(dòng)減少,該行為的性別差異被擾亂[20-21],圍生期BPA暴露減少青春期雌鼠的社會(huì)探究行為[22],但目前還不了解青春期BPA暴露對(duì)社會(huì)行為的影響,其機(jī)制更不清楚.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),青春期BPA暴露顯著降低雌鼠的社會(huì)玩耍能力,并減少其相互嗅探和相互接觸等社會(huì)探索行為.同時(shí)在三室模型的陌生同伴和空?qǐng)A筒的選擇中,一般動(dòng)物更愿意與陌生同伴接觸,即具有一定的社會(huì)探究意愿.但青春期BPA暴露的雌鼠成年后接觸陌生鼠的時(shí)間有所縮短,而對(duì)空?qǐng)A筒的接觸時(shí)間延長,明顯降低陌生鼠/空?qǐng)A筒的嗅探時(shí)間比,表明青春期BPA暴露降低雌鼠成年后社會(huì)玩耍及社會(huì)探索意愿,減弱其社會(huì)互作能力.

情緒是影響動(dòng)物社會(huì)行為的一個(gè)因素,焦慮和抑郁狀態(tài)的動(dòng)物往往表現(xiàn)出較差的社會(huì)玩耍和社會(huì)交互能力.流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),妊娠期母體尿液高BPA水平與3～12歲兒童表現(xiàn)出的高焦慮和抑郁情緒、及多動(dòng)癥相關(guān)[23-24].出生前后BPA暴露的兒童還表現(xiàn)出攻擊行為、自閉癥等多種精神和情緒異常現(xiàn)象[15].本研究結(jié)果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1的BPA加重雌鼠在高架十字迷宮中的焦慮樣狀態(tài)和強(qiáng)迫游泳時(shí)的抑郁樣情緒,同時(shí),這2個(gè)劑量的BPA降低小鼠的社會(huì)玩耍和社會(huì)交互能力,提示青春期BPA暴露導(dǎo)致的動(dòng)物社會(huì)行為減弱可能與其加重的焦慮抑郁樣情緒有關(guān).

作為一種高級(jí)動(dòng)機(jī)行為,社會(huì)行為具有獎(jiǎng)賞價(jià)值,動(dòng)物在與同伴、后代或性伴侶的社會(huì)互作中得到獎(jiǎng)賞[25].因此,社會(huì)動(dòng)機(jī)和獎(jiǎng)賞是社會(huì)行為的動(dòng)力.研究發(fā)現(xiàn),與高級(jí)動(dòng)機(jī)行為相關(guān)的中腦腹側(cè)背蓋區(qū)-紋狀體的DA獎(jiǎng)賞通路對(duì)社會(huì)行為發(fā)育至關(guān)重要[11].大鼠中腦神經(jīng)元DA合成限速酶、紋狀體DA受體密度均在青春期達(dá)到高峰后回落到成年水平,提示DA獎(jiǎng)賞系統(tǒng)在青春期社會(huì)行為發(fā)育中的重要作用[4，11].Trezza等[25]發(fā)現(xiàn)社會(huì)玩耍伴隨著前腦和紋狀體DA水平升高,DA傳遞阻斷可減少社會(huì)玩耍,而Manduca等[26]發(fā)現(xiàn)注射DA再攝取抑制劑安非他命增加社會(huì)玩耍行為.筆者的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),0.40和4.00 mg·kg-1·d-1的BPA暴露上調(diào)紋狀體DAT表達(dá)水平.DAT是一種位于多巴胺能神經(jīng)元突觸前膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可將釋放至突觸間隙的多巴胺主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)再攝取回突觸前.BPA暴露導(dǎo)致DAT蛋白表達(dá)水平升高,加快對(duì)突觸間隙DA的移除而導(dǎo)致紋狀體突觸前DA能神經(jīng)纖維末梢DA傳遞效應(yīng)減弱.同時(shí),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BPA還上調(diào)紋狀體DA受體DR1表達(dá)水平.腦內(nèi)DR1被認(rèn)為在社會(huì)行為中起重要作用,抑制紋狀體DR1可促進(jìn)社會(huì)互作和社會(huì)探究等親社會(huì)行為[27].最近有報(bào)道表明，出生前后BPA暴露改變小鼠中腦DA系統(tǒng)和嗎啡獎(jiǎng)賞活動(dòng)[4],上調(diào)DA轉(zhuǎn)運(yùn)體基因,上調(diào)邊緣前腦DR1而下調(diào)DR2[28],這與筆者的發(fā)現(xiàn)相一致.因此,青春期BPA暴露引起的紋狀體DA遞質(zhì)系統(tǒng)功能改變可能是其影響雌性動(dòng)物社會(huì)行為異常的一個(gè)原因.

內(nèi)源性性激素對(duì)相關(guān)腦區(qū)的調(diào)節(jié)是青春期腦和行為發(fā)育性別差異的主要原因.給發(fā)育中的腦注射睪酮可使青春期雌鼠的玩耍行為雄性化,腦內(nèi)ER敲除的小鼠社會(huì)探究、攻擊和性行為均減少[11].實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低劑量BPA暴露沒有明顯改變腦和血清的雌二醇水平,但是下調(diào)了與社會(huì)行為密切相關(guān)的紋狀體腦區(qū)ERβ蛋白表達(dá).雌激素調(diào)節(jié)腦和行為主要通過ER介導(dǎo),其中腦功能和非生殖相關(guān)行為主要由ERβ介導(dǎo).在以往的研究中實(shí)驗(yàn)室曾發(fā)現(xiàn),長期暴露BPA下調(diào)雌鼠ERβ水平[29].因此,青春期BPA暴露可能通過下調(diào)腦內(nèi)ERβ水平而抑制雌激素對(duì)社會(huì)行為的調(diào)節(jié).

4 結(jié) 論

綜上分析,青春期暴露于低劑量BPA可減少雌鼠社會(huì)玩耍,降低其社會(huì)探究意愿和社會(huì)互作能力.該作用可能與紋狀體腦區(qū)ERβ水平下調(diào)而干擾雌激素對(duì)相關(guān)腦區(qū)DA遞質(zhì)系統(tǒng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)有關(guān),最后導(dǎo)致社會(huì)行為改變.鑒于杏仁核和前額葉與焦慮抑郁情緒相關(guān),今后將進(jìn)一步探討其在BPA影響情緒中的作用.本研究發(fā)現(xiàn)BPA影響社會(huì)行為和情緒的有效劑量為0.40,4.00 mg·kg-1·d-1,根據(jù)體表面積換算成人的藥理劑量為0.032 4，0.324 0 mg·kg-1·d-1,該劑量遠(yuǎn)低于現(xiàn)有BPA的無不良效應(yīng)極限值(50 mg·kg-1·d-1).因此,BPA對(duì)神經(jīng)行為發(fā)育的低劑量毒性作用應(yīng)引起重視.