朱俊平，潘柳婷

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

近幾年，我國(guó)鴨養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，但仍以“小規(guī)模、大群體”的養(yǎng)殖模式為主，使得鴨病流行較為廣泛[1]。鴨病毒性肝炎（DVH）主要引起20 日齡內(nèi)雛鴨的嚴(yán)重死亡，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前主要采取對(duì)種鴨或1 日齡雛鴨免疫疫苗的方式來(lái)預(yù)防DVH[2]。但許多地區(qū)采取主動(dòng)或被動(dòng)免疫后，仍無(wú)法有效控制該病的發(fā)生和流行，這可能與免疫程序是否有效有很大關(guān)系[3]。目前，對(duì)于疫苗免疫劑量和次數(shù)對(duì)鴨DVH 抗體影響的研究較少。本研究旨在了解免疫劑量和次數(shù)對(duì)楓葉鴨種鴨DVH 抗體產(chǎn)生的影響，以期為種鴨場(chǎng)免疫程序制定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2 月齡體質(zhì)量均等的楓葉種鴨120 只（試驗(yàn)組），1 日齡體質(zhì)量均等的無(wú)母源抗體楓葉雛鴨120 只（對(duì)照組），均購(gòu)自山東永惠楓葉種鴨有限公司，按照常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.2 試驗(yàn)試劑

DVH 弱毒活疫苗（CH60 株），由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)；DVH 抗體（DVh-Ab）ELISA 檢測(cè)試劑盒，上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；鴨肝炎病毒AV2111 株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

2 方法

2.1 試驗(yàn)分組及免疫方案

將購(gòu)買(mǎi)的120 只種鴨隨機(jī)分為3 組（A1、A2、A3），每組40 只。按照疫苗使用說(shuō)明書(shū)稀釋疫苗。各組按不同免疫程序免疫DVH 弱毒苗，對(duì)免疫后收獲的第1 周及第4 周種蛋，按常規(guī)方法孵化。

A1 組：留種蛋前3 周，腿部肌內(nèi)注射DVH弱毒苗0.5 mL；A2 組：留種蛋前5 周和前3 周，各腿部肌內(nèi)注射DVH 弱毒苗0.5 mL；A3 組：留種蛋前5 周和前3 周，分別腿部肌內(nèi)注射DVH 弱毒苗0.5 mL 和1 mL。

2.2 雛鴨抗體水平檢測(cè)和攻毒保護(hù)試驗(yàn)

2.2.1 第1 周種蛋孵化雛鴨（B 組）將A1、A2、A3 組種鴨免疫后收獲的第1 周種蛋孵出的雛鴨，對(duì)應(yīng)編號(hào)B1、B2、B3 組，每組120 只；另設(shè)對(duì)照組，為購(gòu)買(mǎi)的120 只1 日齡無(wú)母源抗體雛鴨。試驗(yàn)組和對(duì)照組雛鴨分別在1、4、7、10 d 時(shí)心臟采血，采用ELISA 方法進(jìn)行抗體檢測(cè)；同時(shí)于1、4、7、10 d 分別隨機(jī)取30 只，皮下注射0.1 mL 鴨肝炎病毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，剩余雛鴨和對(duì)照組同期皮下注射生理鹽水0.1 mL。隔離常規(guī)飼養(yǎng)，觀察并記錄各組雛鴨發(fā)病死亡數(shù)量。

2.2.2 第4 周種蛋孵化雛鴨（C 組）將A1、A2、A3 組種鴨免疫后收獲的第4 周種蛋孵出的雛鴨，對(duì)應(yīng)編號(hào)C1、C2、C3 組，每組120 只。試驗(yàn)方法同B 組。

3 結(jié)果與分析

3.1 B 組試驗(yàn)

種鴨接種DVH 疫苗后，分別檢測(cè)B1、B2、B3 組各日齡雛鴨的ELISA 抗體效價(jià)，計(jì)算平均值。結(jié)果顯示：B1 組平均抗體效價(jià)為0.52～0.57，雛鴨攻毒保護(hù)率為73.3%～93.3%；B2 組平均抗體效價(jià)為0.54～0.59，雛鴨攻毒保護(hù)率為86.7%～100%；B3 組平均抗體效價(jià)為0.56～0.63，雛鴨攻毒保護(hù)率為90.0%～100%。從結(jié)果中可以看出，各組的OD值1 日齡最高，之后隨日齡增長(zhǎng)逐漸減少，雛鴨攻毒保護(hù)率也隨之降低（表1）。試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)其他情況導(dǎo)致的死亡。

表1 B 組雛鴨抗體水平測(cè)定和攻毒試驗(yàn)結(jié)果

3.2 C 組試驗(yàn)

種鴨接種DVH 疫苗后，分別檢測(cè)C1、C2、C3 組各日齡雛鴨的ELISA 抗體效價(jià)，計(jì)算平均值。結(jié)果顯示：C1 組平均抗體效價(jià)為0.40～0.46，雛鴨攻毒保護(hù)率為40.0%～56.7%；C2組平均抗體效價(jià)為0.42～0.47，雛鴨攻毒保護(hù)率為50.0%～60.0%；C3 組平均抗體效價(jià)為0.45～0.50，雛鴨攻毒保護(hù)率為56.7%～70.0%（表2）。試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)其他情況導(dǎo)致雛鴨死亡。從結(jié)果中能夠看出，隨日齡增長(zhǎng)，C1、C2、C3 組雛鴨抗體效價(jià)均呈下降趨勢(shì)。

表2 C 組雛鴨抗體水平測(cè)定和攻毒試驗(yàn)結(jié)果

3.3 數(shù)據(jù)對(duì)比

將兩組的檢測(cè)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，OD值B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，說(shuō)明鴨DVH弱毒苗（CH60 株）免疫劑量和免疫次數(shù)的確能夠影響鴨肝炎抗體水平。同時(shí)，攻毒保護(hù)試驗(yàn)顯示，雛鴨保護(hù)率B3＞B2＞B1＞對(duì)照組，C3＞C2＞C1，與雛鴨抗體效價(jià)呈正相關(guān)，說(shuō)明種鴨免疫后產(chǎn)生的母源抗體，能夠保護(hù)雛鴨不受鴨肝炎病毒侵害。C 組OD 值低于B 組，說(shuō)明母源抗體會(huì)隨著種鴨免疫時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，從而降低對(duì)雛鴨的保護(hù)力。種鴨免疫后第4 周種蛋孵出雛鴨的攻毒保護(hù)率仍能夠達(dá)到50%以上，說(shuō)明DVH 弱毒苗（CH60株）免疫效果確實(shí)有效。

4 討論

目前檢測(cè)DVH 抗體的方法主要有間接血凝抑制試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。國(guó)標(biāo) GB/T 17999.5—1999 檢測(cè)DHV-Ⅰ及其抗體的方法為血清中和試驗(yàn)[4]。雖然血清中和試驗(yàn)是公認(rèn)的權(quán)威性、高特異性方法，但其操作繁瑣、耗時(shí)。為此，研究人員開(kāi)始建立其他檢測(cè)方法。如趙新柳等[5]首次建立了間接ELISA方法用于檢測(cè)鴨肝炎抗體，檢出陽(yáng)性率為100%。近幾年很多學(xué)者不斷優(yōu)化間接 ELISA 試驗(yàn)條件，使該法的敏感性和特異性逐步提高[6]。因此，本試驗(yàn)選擇ELISA 檢測(cè)雛鴨母源抗體。本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果略高于孫泉云等[7]的間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果，說(shuō)明本研究所用疫苗效果較好。

由于DVH 病毒主要侵害20 日齡以?xún)?nèi)，尤其是10 日齡內(nèi)的雛鴨，因此做好20 日齡以?xún)?nèi)雛鴨的防疫工作非常重要。目前預(yù)防DVH 常用疫苗主要為滅活苗和弱毒苗。本試驗(yàn)選用DVH 弱毒活疫苗（CH60 株），是因?yàn)樵撘呙缈梢酝ㄟ^(guò)接種種鴨和雛鴨兩種方式進(jìn)行DVH 防控。

有文獻(xiàn)[8]表示，若在雛鴨孵出后再對(duì)其免疫，則雛鴨在抗體產(chǎn)生過(guò)程中易感染DVH 病毒，因此應(yīng)對(duì)種鴨進(jìn)行免疫，將母源抗體通過(guò)卵傳遞給雛鴨，使雛鴨獲得保護(hù)。本試驗(yàn)即通過(guò)對(duì)種鴨免疫，檢測(cè)雛鴨體內(nèi)的母源抗體效價(jià)，以此判斷母源抗體能否保護(hù)雛鴨不受DVH 病毒感染。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，有母源抗體的雛鴨組抗體效價(jià)明顯多于無(wú)母源抗體的雛鴨組，且攻毒后保護(hù)率較高，說(shuō)明母源抗體能夠保護(hù)雛鴨不受DVH 病毒感染，且雛鴨體內(nèi)的抗體水平直接影響攻毒后對(duì)雛鴨的保護(hù)率。

攻毒試驗(yàn)結(jié)果證明，間隔2 周再免疫同等劑量DVH 弱毒活疫苗（CH60）種鴨，比免疫1 次產(chǎn)生的抗體效價(jià)要高，說(shuō)明免疫次數(shù)能夠影響產(chǎn)生鴨肝炎抗體水平。Rispensls[9]研究表明，種鴨免疫后第6 周進(jìn)行2 次弱毒疫苗免疫，免疫后9 個(gè)月左右時(shí)間內(nèi)，其孵出的雛鴨能獲得較好的天然被動(dòng)免疫。叢秋實(shí)[10]研究表明，在22 周進(jìn)行初次免疫，24 周二次接種加強(qiáng)免疫，將會(huì)產(chǎn)生更為強(qiáng)的免疫效力。Hwang 等[11]也證實(shí)，為保證后代雛鴨有足夠高的抗體水平，對(duì)種鴨必須進(jìn)行2 次或3 次弱毒苗免疫。本試驗(yàn)結(jié)果也基本與上述研究結(jié)果相符。

即使僅免疫1 次，且免疫量為1 劑量/羽份，雛鴨攻毒保護(hù)率也能達(dá)到60%以上，說(shuō)明DVH 弱毒苗（CH60 株）非常有效。

綜上所述，DVH 的免疫接種非常重要，能夠有效減少養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，可以采用種鴨、雛鴨共同免疫的方法。但對(duì)雛鴨免疫，還需考慮免疫時(shí)雛鴨體內(nèi)是否有母源抗體的干擾。有文獻(xiàn)[12]表明，若母源抗體較高，則說(shuō)明母源抗體還具有很好的保護(hù)性，雛鴨可在7～10 日齡免疫；若較低，則說(shuō)明母源抗體已不能起到保護(hù)作用，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行免疫，需要在1～3 日齡免疫。另外，國(guó)內(nèi)外不同學(xué)者所測(cè)不同疫苗達(dá)到較好免疫效果所用的免疫劑量和次數(shù)有所不同，這可能與疫苗種類(lèi)有關(guān)。

因此，不同養(yǎng)鴨場(chǎng)在免疫前，應(yīng)考慮不同疫苗間的免疫效果及相互作用，結(jié)合鴨肝炎母源抗體在雛鴨體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律，測(cè)定本場(chǎng)雛鴨體內(nèi)抗體水平，最終制定出適合本場(chǎng)的DVH 免疫程序，這樣可最大程度減少DVH 引起的經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié)論

研究表明：對(duì)種鴨進(jìn)行DVH 疫苗免疫的次數(shù)和劑量，均能影響雛鴨體內(nèi)抗體水平的高低，進(jìn)而影響對(duì)雛鴨的保護(hù)力；雛鴨母源抗體會(huì)隨著種鴨免疫時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，從而降低對(duì)雛鴨的保護(hù)力；對(duì)種鴨免疫DVH 弱毒苗（CH60 株）能夠?qū)Ψ醭龅碾r鴨提供較高的母源抗體。因此，為避免母源抗體干擾，建議對(duì)種鴨進(jìn)行DVH 弱毒苗（CH60 株）免疫，為保證對(duì)雛鴨提供較強(qiáng)免疫的保護(hù)，最好對(duì)種鴨進(jìn)行加強(qiáng)免疫。