成偉偉，陳伯祥，楊 明，趙子惠，常攀峰

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

羊傳染性膿皰（俗稱羊口瘡）是由羊傳染性膿皰病毒（ORFV）引起的一種以山羊和綿羊嘴唇和舌鼻等部位形成水泡、膿皰和結(jié)成厚痂的一種人獸共患傳染病[1]。該病毒主要感染2～6 月齡的羔羊和部分免疫力下降的成年羊，被感染羔羊常因繼發(fā)感染而死亡，被感染成年羊可因進(jìn)食困難導(dǎo)致減產(chǎn)甚至死亡[2]。該病在規(guī)模化羊場(chǎng)流行廣泛，給養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

OVIFNR 蛋白是ORFV 的抗性蛋白[3]，具有抗干擾素功能。OVIFNR 蛋白依靠其羧基末端的一段保守性基序，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合dsRNA 和病毒復(fù)制中間體，從而抑制干擾素（IFN）誘導(dǎo)的蛋白激酶PKR 的激活，達(dá)到阻止宿主細(xì)胞發(fā)揮抑制病毒蛋白翻譯的作用[4-5]。目前，對(duì)OVIFNR 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能還不是很清楚。所以，本研究以從羊口瘡確診病例的嘴唇結(jié)痂擴(kuò)增所得的OVIFNR基因序列為研究對(duì)象，應(yīng)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行OVIFNR基因序列比較和ORFV 遺傳進(jìn)化分析，以及OVIFNR蛋白的理化特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分析，以期為OVIFNR 蛋白的功能研究和ORFV 檢測(cè)方法的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘肅省某羊場(chǎng)羊口瘡確診病羊的嘴唇結(jié)痂。ExTaqDNA聚合酶、dNTP、IPTG、X-gal、pMD18-T，均購(gòu)自寶生物工程有限公司；DNA 提取試劑盒，購(gòu)自QIAGEN 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自天根生化有限公司；膠回收和質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自AXYGEN 公司。

1.2 結(jié)痂組織DNA 提取

取結(jié)痂組織100 mg 置于研缽中，加入液氮研成粉末；參照組織基因組DNA 提取試劑盒（QIAGEN）說明書的要求和步驟，提取總DNA；經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，-80 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)、基因擴(kuò)增

參照GenBank公布的ORFVOVIFNR（JN565695.1）基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上引物：CCCAAGCTTATGGCCTGCGAGTGCGCGTCT（下劃線部分為HindIII 酶切位點(diǎn)）；下引物：CGCGGATCCTTAGAAGCTGATGCCGCAGTTGTTGATG（下劃線部分為BamHI 酶切位點(diǎn)）。引物均由上海桑尼有限公司合成。以1.2 提取的基因組DNA為模板，加入上下游引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為：模板5 μL、premix ExTaq25 μL，上下引物各1 μL，ddH2O 加至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取反應(yīng)液5～10 μL，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參照PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（AXYGEN）說明，將PCR 產(chǎn)物切膠回收純化，與pMD18-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞；涂布含氨芐青霉素、X-gal 和IPTG 的選擇平板上培養(yǎng)12～16 h，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑取白色單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)6 h 后進(jìn)行菌液PCR 鑒定。擴(kuò)增條件與反應(yīng)參數(shù)與上述PCR 反應(yīng)相同。

1.4 序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析

將上述PCR 鑒定為陽(yáng)性的菌株，送上海桑尼測(cè)序公司測(cè)序；應(yīng)用DNAstar 軟件，對(duì)測(cè)序得到的基因序列和GenBank 公布的參考序列，分別進(jìn)行核苷酸和氨基酸水平的同源性分析和遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建[6-7]。

1.5 OVIFNR 蛋白理化特性和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

運(yùn)用在線工具ProtParam（網(wǎng)址為https://web.expasy.org/protparam/），分析OVIFNR 蛋白的理化特性[8]；利用DNAstar 軟件的KyteDolittle 方法，預(yù)測(cè)OVIFNR 蛋白的親水性和疏水性；利用在線軟件TMHMM 和SingnalIP 分析工具（網(wǎng)址為http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/和http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），預(yù)測(cè)OVIFNR蛋白分子的跨膜區(qū)和信號(hào)肽[9]；利用DNAstar 軟件，進(jìn)行OVIFNR 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析[10]。將OVIFNR 蛋白的氨基酸序列提交至在線工具Swiss-Model（網(wǎng) 址 為https://swissmodel.expasy.org/），構(gòu)建OVIFNR 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型[11-12]。

1.6 OVIFNR 蛋白的B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

以O(shè)VIFNR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果為參數(shù)，運(yùn)用在線工具ABCpred（網(wǎng)址為http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/），綜合分析預(yù)測(cè)OVIFNR 蛋白B 細(xì)胞表位[13-14]。

2 結(jié)果

2.1 序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析

PCR 擴(kuò)增得到大小約552 bp 的基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致。序列測(cè)定結(jié)果顯示，OVIFNR基因大小為552 bp，編碼184 個(gè)氨基酸，GC 含量為60.51%。將該基因序列提交GenBank，獲得序列號(hào)為KF916586，將所含該基因的毒株命名為orfvchGanSu。將GenBank 上公布的參考毒株（挑選了14 株，具體信息見表1）以及orfv-chGanSu 的OVIFNR基因進(jìn)行核酸序列的多序列比對(duì)。結(jié)果（表2）顯示：有兩對(duì)毒株的OVIFNR基因序列同源性為100%，分別是Ena 和Matsumoto 株、Hoping 和Nantou 株。orfv-chGanSu 的OVIFNR基因序列與Hoping 和Nantou 株的同源性最高，為99.6%；orfv-chGanSu 與Hoping 和Nantou 株 在198 位和273 位上分別有2 個(gè)單核苷酸不同（在198 位 上orfv-chGanSu 是C，Hoping 和Nantou是T，在273 位 上orfv-chGanSu 是T，Hoping 和Nantou 是C），但都沒有氨基酸序列的不同。orfvchGanSu 和D1701 株的同源性最低，為95.3%；orfv-chGanSu 和NZ2、OV-SA00、OV-IA82 株的同源性分別為96.0%、97.5%、96.7%。這些數(shù)據(jù)說明ORFV 各毒株的OVINR基因發(fā)生了突變（包括orfv-chGanSu）。

這14株參考毒株和orfv-chGanSu 株OVIFNR 蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見表2 左下部分。在所有105 個(gè)比對(duì)組合中，有7 個(gè)同源性為100%，其中Hoping、Nantou、ShanX 和orfvchGanSu 株的OVIFNR 蛋白氨基酸序列完全同源，Ena 和Matsumoto 完全同源。orfv-chGanSu與已公布的參考株OVIFNR 蛋白氨基酸序列的同源性為94.1%～100%，其中與D1701、NZ2、OV-IA82、OV-SA00 的同源性分別為94.1%、95.1%、95.1%、97.8%。通過遺傳進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)，本次克隆的OVIFNR基因毒株與Hoping、ShanX、Nantou 株的關(guān)系最近，處于同一分支（圖1）。這一點(diǎn)也為病毒存在的地理差異提供了證據(jù)（orfv-chGanSu、Hoping、ShanX、Nantou 都是國(guó)內(nèi)毒株）。

表1 14 株ORFV 參考毒株信息

表2 ORFV 各毒株的OVIFNR 基因核酸和氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果

圖1 所擴(kuò)增的OVIFNR 基因毒株與參考毒株遺傳進(jìn)化樹

2.2 OVIFNR 蛋白的理化特性和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

orfv-chGanSu 的OVIFNR蛋白理化特性如表3 所示。用KyteDolittle 法進(jìn)行親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，OVIFNR 蛋白具有較強(qiáng)的親水性，OVIFNR 蛋白親水性區(qū)主要集中在12～29、30～46、47～64、65～85、120～140、156～165 等6 個(gè)區(qū)段（圖2）；使用TMHMMH 和SOSUI服務(wù)器分析發(fā)現(xiàn)，OVIFNR 蛋白無跨膜區(qū)和信號(hào)肽。

OVIFNR 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3 所示：OVIFNR 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4 種類型，所占比重分別為68.64%、7.56%、15.13%和9.18%；OVIFNR蛋白的α 螺旋主要位于1～41、67～90、94～105、111～130、150～174 區(qū)段，β 折疊主要位于42～43、47～50、59～61、141～144、174～177、182～184 區(qū)段，β 轉(zhuǎn)角分別位于43～48、51～54、56～59、61～63、91～93、105～106、131～137、138～141、146～147、177～181 區(qū)段，無規(guī)卷曲分別位于56～58、63～67、93～95、106～112、147～149、181～182 區(qū) 段。從 構(gòu)建的OVIFNR 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）可以看出，OVIFNR 蛋白結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，在OVIFNR 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中α 螺旋占據(jù)較多的構(gòu)象。

2.3 OVIFNR 蛋白B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

利用ABCpred 預(yù)測(cè)的B 細(xì)胞抗原表位見表4。以預(yù)測(cè)的OVIFNR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲為參數(shù)，綜合篩選出OVIFNR 蛋白的優(yōu)勢(shì)B 細(xì)胞抗原表位位于41～48、51～54、56～67、91～95、105～112、131～141、146～149、177～181 區(qū)段。

表3 OVIFNR 蛋白的理化特性預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 OVIFNR 蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果

圖3 OVIFNR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 OVIFNR 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果

表4 OVIFNR 蛋白B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

將本研究中擴(kuò)增所得的OVIFNR基因序列與14 株ORFV 的OVIFNR基因序列比較發(fā)現(xiàn)，沒有同源性達(dá)到100%的毒株，與Hoping 和Nantou 株的同源性最高達(dá)到了99.6%。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Hoping、Nantou、ShanX 和orfv-chGanSu 等 毒 株的OVIFNR 蛋白氨基酸序列完全同源。通過遺傳進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)，本次克隆的OVIFNR基因毒株與Hoping、ShanX、Nantou 等毒株的關(guān)系最近，處于同一分支。這可能與地理分類有關(guān)，因?yàn)閛rfvchGanSu、Hoping、ShanX、Nantou 都是國(guó)內(nèi)毒株。OVIFNR 蛋白理化特性預(yù)測(cè)表明，OVIFNR 蛋白半衰期長(zhǎng)達(dá)30 h。如果將該蛋白作為免疫抗原，那么其在宿主體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在較長(zhǎng)時(shí)間。OVIFNR 蛋白有較強(qiáng)的親水性，無跨膜區(qū)，推測(cè)該蛋白可以實(shí)現(xiàn)高表達(dá)量的可溶性表達(dá)。預(yù)測(cè)的OVIFNR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含有豐富的α 螺旋結(jié)構(gòu)和β 轉(zhuǎn)角，推測(cè)出OVIFNR 蛋白比較穩(wěn)定，含有較多的B 細(xì)胞抗原表位。三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建可以較直觀地展現(xiàn)OVIFNR蛋白形態(tài)，從而為OVIFNR 蛋白功能的進(jìn)一步研究提供可視化依據(jù)。

目前，基于生物信息學(xué)的B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)方法發(fā)展迅速，已出現(xiàn)了多種方法，如基于多項(xiàng)物理、化學(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)的Bcepred 方法，基于模擬肽的EpiSearch 在線方法和基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的ABCpred 方法，其中ABCpred 是應(yīng)用比較廣泛和具有較高準(zhǔn)確率的預(yù)測(cè)方法[15-16]。本研究運(yùn)用ABCpred 方法預(yù)測(cè)OVIFNR 蛋白B 細(xì)胞抗原表位，并以蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果為參數(shù)進(jìn)行綜合篩選，得到了具有較高可信度的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。