彭小薇，吳方達(dá)，劉郁夫，董 浩，孫永健，畢一鳴，張存瑞，劉林青，韓 燾

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 102618；2.寧德市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建寧德 352000；3.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局，北京 100125）

布魯氏菌病（以下簡(jiǎn)稱(chēng)布?。┦鞘澜鐒?dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報(bào)動(dòng)物疫病，目前在全球160 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行[1]。近年來(lái)，由于我國(guó)牛羊養(yǎng)殖量快速增長(zhǎng)，地區(qū)間牛羊無(wú)序調(diào)運(yùn)，畜間和人間布病疫情有加重趨勢(shì)。2014 年全國(guó)共報(bào)告人感染病例57 222 例，到達(dá)歷年峰值[2]。

疫苗免疫是防控動(dòng)物布病的主要手段之一。目前，在國(guó)內(nèi)使用的弱毒活疫苗，包括豬種S2 株、牛種A19 株和羊種M5 株，其在防控布病流行中發(fā)揮了重要作用。然而這些疫苗株仍存在局限性，如引起懷孕動(dòng)物流產(chǎn)、毒力返強(qiáng)以及對(duì)人有感染性和干擾臨床血清學(xué)檢測(cè)等[3]。

ClpP 蛋白是一種保守的肽酶，可以與不同亞基組成Clp 蛋白酶復(fù)合體。在多種病原菌中，ClpP 蛋白與細(xì)菌致病性密切相關(guān)[4-5]。目前，該蛋白的功能及其與細(xì)菌毒力的關(guān)系尚沒(méi)有相關(guān)研究。本研究構(gòu)建了牛種布魯氏菌clpP基因缺失株，測(cè)定了該缺失株在巨噬細(xì)胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力，并評(píng)價(jià)了用clpP基因缺失株免疫小鼠后產(chǎn)生的免疫保護(hù)力，從而為揭示布魯氏菌的致病機(jī)制和布病疫苗候選株的篩選提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

牛種布魯氏菌2308 株[6]，由國(guó)家動(dòng)物布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，購(gòu)于天根生化科技有限公司；同源重組質(zhì)粒pBluscript ⅡKS（+）和廣宿主基因克隆質(zhì)粒pBBR1MCS，由國(guó)家動(dòng)物布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室保存。SPF 級(jí)4～6 周齡雌性BALB/c 小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有涉及布魯氏菌的實(shí)驗(yàn)操作，均在中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生物安全3 級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，購(gòu)于天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)于OMEGA 公司；Premix ExTaq聚合酶，KpnI、BamHI 限制性?xún)?nèi)切酶，購(gòu)自TaKaRa 公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），購(gòu)于BD 公司；胰蛋白胨、酵母浸出膏，購(gòu)于Sigma 公司。

1.3 同源重組質(zhì)粒和回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的牛種布魯氏菌2308 株基因組DNA為模板，使用引物DclpP-UF/UR 和DclpP-DF/DR，分別擴(kuò)增clpP基因的上下游同源臂片段；以回收的上下游同源臂片段為模板，使用引物DclpP-UF 和DclpP-DR 進(jìn)行連接PCR 擴(kuò)增；回收連接PCR 產(chǎn)物并經(jīng)過(guò)BamHI 和KpnI 雙酶切后，插入同樣經(jīng)雙酶切的pBluscript ⅡKS（+）質(zhì)粒中，獲得質(zhì)粒pBluscript-clpP 載體；最后，使用卡那霉素抗性基因擴(kuò)增引物（Kan-F/R）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并將擴(kuò)增的卡那霉素抗性基因片段，經(jīng)XhoI 單酶切插入pBluscript-clpP 質(zhì)粒中，獲得同源重組質(zhì)粒pBlue-clpP::Kan。

以提取的牛種布魯氏菌2308 株基因組DNA為模板，應(yīng)用引物對(duì)CclpP-F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（擴(kuò)增片段包括clpP基因的ORF 及上下游啟動(dòng)子序列）；膠回收PCR 產(chǎn)物，使用KpnI 和BamHI 對(duì)DNA 片段和pBBR1MCS 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化DH5α，用含氯霉素的LB 平板進(jìn)行篩選，經(jīng)PCR 和測(cè)序鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒，將其命名為pBBRCclpP。

構(gòu)建同源重組和互補(bǔ)質(zhì)粒的引物，參照牛種布魯氏菌2308 株clpP基因片段（BAB1_1132）進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由中美泰和有限公司合成。引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1，相關(guān)測(cè)序試驗(yàn)由中美泰和有限公司完成。

1.4 clpP 基因缺失株和回補(bǔ)株的構(gòu)建

將牛種布魯氏菌2308 株單菌落接種于10 mL的TSB 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下，震蕩培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期；將細(xì)菌在4 ℃低溫條件下離心，去除培養(yǎng)基上清，然后經(jīng)4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌去離子水洗滌3 次；取78 μL 洗滌后的牛種布魯氏菌2308株菌液和5 μL pBlue-clpP::Kan 質(zhì)粒，混勻后加入電擊杯，使用“Agr”的電轉(zhuǎn)參數(shù)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；將電擊后的細(xì)菌加入500 μL TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h 后，取200 μL 涂布在卡那霉素抗性的TSA 平板培養(yǎng)基上，并置于37 ℃溫箱靜置培養(yǎng)3～7 d；待長(zhǎng)出單菌落后，分別經(jīng)氨芐青霉素和卡那霉素抗性的平板培養(yǎng)基篩選，并采用PCR 鑒定是否為clpP基因缺失株（ΔclpP）。

表1 引物序列

回補(bǔ)菌株構(gòu)建方法與clpP基因缺失株構(gòu)建方法類(lèi)似，同樣采用電轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建的pBBRCclpP 質(zhì)粒導(dǎo)入clpP基因缺失株，通過(guò)氯霉素抗性的平板培養(yǎng)基進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，并采用PCR 方法進(jìn)一步鑒定是否為回補(bǔ)菌株（CclpP）。

1.5 細(xì)胞感染試驗(yàn)

用TSB 培養(yǎng)基，將2308、ΔclpP和CclpP菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進(jìn)行細(xì)菌平板計(jì)數(shù)后放至4 ℃冰箱暫存。用3% FBS 的DMEM，將小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞懸液稀釋至5×105cell/mL；將0.5 mL細(xì)胞懸液加到24 孔細(xì)胞板中，即每孔細(xì)胞數(shù)為2.5×105個(gè)。根據(jù)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將布魯氏菌以MOI=100:1 的劑量接種RAW264.7 細(xì)胞，500×g離心5 min，然后置于37 ℃孵育1 h；感染結(jié)束后，換成含50 μg/mL 慶大霉素的細(xì)胞維持液處理1 h，殺滅胞外細(xì)菌，最后換成含20 μg/mL 慶大霉素的維持培養(yǎng)液；取感染后1、12、24、48、72 h 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)胞內(nèi)細(xì)菌存活數(shù)，做3 個(gè)復(fù)孔。試驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.6 小鼠感染試驗(yàn)

用TSB 培養(yǎng)基將布魯氏菌2308、ΔclpP、CclP菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)后置于4 ℃冰箱暫存。根據(jù)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果，用生理鹽水將細(xì)菌稀釋至1×106CFU/mL，并以0.1 mL 的劑量腹腔注射4～6 周齡SPF 級(jí)BALB/c 小鼠（1×105CFU/只）。

分別于攻毒后1 周和4 周處死小鼠，無(wú)菌采集小鼠脾臟，加1 mL 生理鹽水研磨脾臟組織；10倍倍比稀釋后，涂布TSA 平板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，計(jì)算脾臟細(xì)菌載量。

1.7 小鼠體內(nèi)持續(xù)存活期評(píng)價(jià)

在小鼠模型中，評(píng)價(jià)clpP缺失株在小鼠模型中的脾臟殘余毒力，同時(shí)設(shè)置A19 疫苗株對(duì)照組和2308 強(qiáng)毒株對(duì)照組。具體試驗(yàn)步驟同1.6。

1.8 clpP 基因缺失株免疫保護(hù)力測(cè)定

試驗(yàn)步驟參照OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》（2004 版）中關(guān)于布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)的內(nèi)容進(jìn)行。將36 只4～6 周齡BALB/c 小鼠分成3組：clpP基因缺失株免疫組、A19 疫苗對(duì)照組和PBS 陰性對(duì)照組，每組12 只；分別以1×105CFU/只的劑量腹腔接種小鼠；免疫8 周后，每個(gè)免疫組分別以牛種布魯氏菌強(qiáng)毒2308 株和羊種布魯氏菌強(qiáng)毒M28 株腹腔接種小鼠，攻毒劑量均為2×105CFU/只；攻毒2 周后剖殺小鼠，無(wú)菌采集小鼠脾臟，統(tǒng)計(jì)脾臟質(zhì)量和載菌量，計(jì)算免疫保護(hù)單位，以此來(lái)評(píng)價(jià)ΔclpP和A19 菌株的免疫保護(hù)效果。免疫保護(hù)單位為PBS 注射組與免疫組小鼠平均脾臟載菌量取10 的對(duì)數(shù)的差值。

2 結(jié)果

2.1 clpP 基因缺失株和回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

將同源重組質(zhì)粒pBlue-clpP::Kan 電轉(zhuǎn)至2308株后，經(jīng)氨芐青霉素和卡那霉素平板篩選，得到具有卡那霉素抗性且對(duì)氨芐青霉素敏感的布魯氏菌clpP基因缺失株。使用DclpP-UF/DR 引物進(jìn)一步進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)親本株2308 可擴(kuò)增出約1 400 bp 大小的片段，而突變株可以擴(kuò)增出約2 400 bp 大小的片段（圖1），證明基因缺失株ΔclpP構(gòu)建成功。

將回補(bǔ)質(zhì)粒PBBR-CclpP 電轉(zhuǎn)至基因缺失株ΔclpP后，經(jīng)氯霉素平板篩選和進(jìn)一步PCR 驗(yàn)證，證明clpP基因缺失回補(bǔ)菌株（CclpP）構(gòu)建成功。

圖1 親本株與基因缺失株的PCR 鑒定結(jié)果

2.2 細(xì)胞感染試驗(yàn)

為評(píng)價(jià)2308、ΔclpP和CclpP等菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力，在體外進(jìn)行RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞系感染試驗(yàn)。結(jié)果如圖2 所示：在相同感染劑量下（MOI=100:1），感染1 h 和12 h 后，感染細(xì)胞內(nèi)2308、ΔclpP及CclpP的細(xì)菌數(shù)無(wú)顯著差異；感染24、48 和72 h 后，ΔclpP菌株感染的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)顯著低于親本株2308 和回補(bǔ)株CclpP，說(shuō)明clpP基因缺失可顯著降低布魯氏菌在巨噬細(xì)胞感染模型中的胞內(nèi)增殖能力。

圖2 牛種布魯氏菌2308、ΔclpP 和Cclp在RAW264.7 細(xì)胞中的胞內(nèi)增殖情況

2.3 小鼠感染試驗(yàn)

將 親 本 株2308 以 及ΔclpP和CclpP株，以1×105CFU/只的劑量腹腔注射4～6 周齡SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠（每組5 只），并分別在感染后1周和4 周剖殺小鼠，通過(guò)脾臟質(zhì)量和脾臟載菌量評(píng)價(jià)細(xì)菌毒力。結(jié)果如圖3 所示：在感染后1 周和4周，ΔclpP株感染組小鼠脾臟質(zhì)量和載菌量顯著低于2308 株感染組；在感染后4 周，80%（4/5）的ΔclpP株感染組小鼠已經(jīng)在體內(nèi)清除細(xì)菌，而親本株2308 和回補(bǔ)菌株CclpP感染組的脾臟載菌量仍維持在高位。

2.4 clpP 基因缺失株持續(xù)期評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)clpP基因缺失株的安全性，首先在BLAB/c 小鼠模型中，檢測(cè)clpP基因缺失株在小鼠脾臟中的持續(xù)期，以親本菌株2308 為強(qiáng)毒對(duì)照、疫苗株A19 為疫苗株對(duì)照，分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)剖殺小鼠，以小鼠脾臟質(zhì)量、脾臟載菌量為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示（圖4）：clpP基因缺失株的殘余毒力顯著低于2308 株和疫苗株A19；clpP基因缺失株可在感染后6 周完全從小鼠脾臟中被清除；與2308 株、A19 疫苗株相比，clpP基因缺失株感染小鼠后并不引起明顯的脾臟腫脹。

圖3 牛種布魯氏菌2308、ΔclpP 和CclpP 感染后小鼠的脾臟質(zhì)量及載菌量

圖4 2308、ΔclpP 和A19 株感染小鼠3～49 d 后在脾臟中的殘余毒力

2.5 clpP 基因缺失株免疫保護(hù)力評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)clpP基因缺失株免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抵抗同源和異源攻毒的免疫保護(hù)力，在小鼠模型中進(jìn)行了免疫保護(hù)力測(cè)定。結(jié)果如表2 所示：疫苗株A19 可為同源和異源攻毒提供良好的免疫保護(hù)力，抵抗同源（牛種2308 強(qiáng)毒）攻毒的脾臟免疫保護(hù)單位為2.41，抵抗異源（羊種M28 強(qiáng)毒）攻毒的脾臟免疫保護(hù)單位為4.23；而clpP基因缺失株僅能提供微弱免疫保護(hù)力，免疫保護(hù)單位分別為0.67（P〈0.05）和0.46（P〈0.001），免疫保護(hù)效果明顯低于疫苗株A19。

3 討論

在病原菌感染過(guò)程中，蛋白酶水解作用與細(xì)菌的毒力密切相關(guān)。在細(xì)胞質(zhì)中，Lon 和Clp 是發(fā)揮蛋白水解作用的主要蛋白酶，可通過(guò)降解毒力調(diào)控因子直接參與調(diào)控毒力，也可調(diào)控細(xì)菌在不利環(huán)境中的耐受能力，從而間接影響毒力。在布魯氏菌中，研究表明，Lon 蛋白酶與布魯氏菌抵御多種應(yīng)激環(huán)境密切相關(guān)。除此之外，Lon 蛋白酶功能的缺失還會(huì)影響布魯氏菌對(duì)小鼠的早期感染[7-8]。然而，在布魯氏菌中，ClpP 蛋白酶的功能一直是未知的。本研究首次構(gòu)建了牛種布魯氏菌clpP基因缺失菌株，并通過(guò)巨噬細(xì)胞感染試驗(yàn)和小鼠模型感染試驗(yàn)，證明了ClpP 蛋白酶與布魯氏菌毒力密切相關(guān)。

表2 clpP 基因缺失株免疫保護(hù)力測(cè)定結(jié)果

疫苗免疫是防控家畜布病的重要手段。但是目前國(guó)內(nèi)使用的布魯氏菌疫苗均存在對(duì)人有感染風(fēng)險(xiǎn)、干擾血清學(xué)鑒別診斷等缺點(diǎn)。因此，研究人員利用分子生物學(xué)技術(shù)，嘗試對(duì)疫苗株進(jìn)行改造，在不影響疫苗株免疫原性的前提下，提高其安全性，并使其具有成為分子標(biāo)記從而進(jìn)行鑒別診斷的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，clpP基因缺失株的毒力顯著低于親本菌株2308，并且在小鼠體內(nèi)存活時(shí)間也短于A19 疫苗株，并且不引起小鼠脾臟腫脹，說(shuō)明相比A19 疫苗株，clpP基因缺失株的安全性得到顯著提升，但是clpP基因缺失株免疫小鼠后抵抗同源和異源攻毒能力卻明顯低于A19 疫苗株。

布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，宿主在抗布魯氏菌感染的過(guò)程中，細(xì)胞免疫發(fā)揮了主要作用，體液免疫發(fā)揮次要作用[9]。因此，一種優(yōu)秀的布魯氏菌疫苗除了不形成持續(xù)性感染，還應(yīng)能在宿主體內(nèi)存活一定時(shí)間，從而充分激活機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。clpP基因缺失株很可能是由于過(guò)快地被宿主清除，無(wú)法激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生足夠的細(xì)胞免疫反應(yīng)，所以無(wú)法保護(hù)小鼠抵御布魯氏菌同源菌株和異源菌株的感染。